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朊病毒的检测(下)


录入时间:2012-7-16 8:50:48 来源:百度文库

 3  借助特殊仪器的检测方法
        (1)电镜法:电镜检测瘙痒病相关纤维(SAF)是朊病毒检测的另外一种方法。现在认为PrPsc是SAF的组成成分。瘙痒病相关纤维为杆状、纤维状结构,其实是PrPsc在用去垢剂提取过程中,不同提取条件下形成的产物,感染生物体的组织切片中尚未发现SAF。基本步骤是:将被检组织置于10%N-laruoylsarcosine溶液中匀浆,差速离心、PK消化,重悬于蒸馏水中,负染,电镜观察。镜下可见两种瘙痒病特有的大分子纤维。电镜检查SAF灵敏度较低,不如免疫印迹方法。
        (2)毛细管SDS-凝胶电泳:该法主要是通过理化方法--差速、超速离心,sodium N-lauroylsarcosine、PK处理,提纯PrPsc,然后在 Beckman P/ACE 5 500上进行毛细管SDS-凝胶电泳。根据各组分通过检测器时,在214 nm波长处产生吸收峰的时间和峰形,鉴别出瘙痒病病原因子PrPsc。该法标本用量少,无需免疫学试剂,判断直观;缺点是需用超速离心机、专用毛细管电泳仪。
        (3)荧光标记肽链的毛细管电泳免疫测定法:该法是根据免疫竞争原理测定,采用无区带毛细管电泳技术结合免疫荧光技术,检测标本中微量的PrPse。其基本原理是将人工合成PrPsc特异性肽链(142~154)标记上荧光,然后与一定量的特异性抗体、羊脑提取物一起电泳,荧光标记的肽链与抗体结合后,迁移率发生改变,从而与游离的标记肽链分离开来,由于抗体的量只能结合大约50%的标记肽链,因而荧光标记的结合型肽链与游离型标记肽链的比例是固定的。当羊脑提取物中存在微量的PrPsc,由于其与标记肽链竞争结合抗体,导致结合型肽链与游离型肽链的比例发生改变,从而被仪器检测出来。该方法灵敏度很高,能检测到135 pg的PrPsc,可用于检测朊病毒水平很低的脑外组织(如血液等)。
        (4)双色强荧光目标扫描法:该法是运用共聚焦双色荧光相关分光镜技术检测极其微量的朊病毒。其基本原理是利用致病性 PrPres,在适当条件下自我复制和自发聚集的特点,将重组PrP(rPrP)标记上绿色荧光,PrPres与正常构象的rPrP结合后,通过变构复制出大量的异常构象的rPrP盖。由于PrPres在一定条件下可自发聚集,从而使PrPres周围聚集了大量的rPrP盖,使其荧光强度超过游离的rPrP50倍。同时为了增强实验的特异性,又加入了标记上红色荧光的特异性单抗,使PrPres- rPrP盖聚集体又标记上红色荧光。只有同时发出高强度红、绿荧光的颗粒,才能被检测仪器判为PrPres。
        目前,朊病毒领域的许多方面对人类来说还有一片空白或知之甚少,如朊病毒突破种属屏障传播的程度,通过生物制品和临床医疗传播的危险性,其他传播途径的探知,以及朊病毒致病机制的研究等等,诸多方面的问题都离不开朊病毒的检测,朊病毒检测方法的发展必将为朊病毒的研究开辟广泛的前景。

 

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