链霉菌原生质体的转化

链霉菌原生质体的转化 1. 将最多5 ul的DNA（质粒或酶连产物）加于已经装有50 ul原生质体的指型管（1.5 ml）的管壁上（不与原生质体接触）。 2. 吸取200ul的25% PEG4000（PEG应先灭菌，再用P Buffer配置），将DNA冲入原生质体中，小心抽吸几次使之混匀。 3. 将混合物涂布于R5平板上（不含任何抗生素）。 4. 30度培养14~20 hr后（待原生质体再生后，即平板呈雾状），用含有适当抗生素的1 ml无菌水溶液覆盖。 5. 再培养1~2 d后，可以看到小的转化子菌落长出。 PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化 1. 将天蓝色链霉菌库斯质粒转化进入大肠杆菌BW25113/pIJ790*菌株中，此步可用常规的CaCl2 法。（pIJ790带有cat基因和对温度敏感的复制区，培养时温度要严格控制在30゜C以下） 2. 培养含库斯质粒的BW25113/pIJ790菌株：从平板上挑取大肠杆菌单菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp的SOB-MgSO4 （不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM ）中，30゜C摇床培养过夜。 3. 取一部分过夜培养物至25ml新鲜的SOB-MgSO4 培养基（含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp）中，菌体终浓度为1% ，添加250ul 1M L-阿拉伯糖诱导λ/red 重组系统。 4. 30゜C ，200rpm摇床培养3-5h 至OD600~0.6 。 5. 将培养物倒入预冷的30ml离心管中，冰上置10min(从此细胞温度要保持在0~4゜C)。4000rpm 4゜C离心 5min。 6. 弃掉上清，加1ml预冷的10%甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10%甘油,摇匀。 7. 4000rpm 4゜C离心 5min，弃掉上清，用10%甘油洗涤。重复上面操作：4000rpm 4゜C离心5min，尽量弃去上清，用残留液将细胞打散。（感受态细胞浓度越高电转效果越好） 8. 在预冷的0.2cm的电转化杯中混合50ul感受态细胞与1-2ul PCR产物（经纯化，可尽量浓，但不能加得过多），混匀后立即电击，电击条件：200Ω,25uF,2.5kv, 电击结果为4.5~4.9ms 较理想。（电转化杯在70％乙醇中保存，用前先在无菌环境下用无水乙醇洗一下，再吹干，放冰上预冷，无水乙醇能加快吹干的速度。也可以选择0.1cm的电转化杯，但电击的参数就得变为：1.8 kV，？Ω,?uF） 9. 立即加1ml预冷的SOC，37゜C诱导培养40min（如需在同一库斯质粒上中断基因，则30゜C诱导培养）。 10. 涂LA（含100ug/ml Amp及与电转片段携带的抗性标记相应的抗生素）平板，37゜C过夜培养。（转化子中含有两种质粒，分别是重组前和重组后的质粒，所以要抽质粒再转化一次DH5）

 

上一篇：脂多糖(LPS,lipopolysaccharide)：

下一篇：古细菌(Archaea)的应用