致泻大肠埃希氏菌检验

 
1  主题内容与适用范围 
本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法。 
本标准适用于食品和食物中毒样品中致泻大肠埃希氏菌的检验。 
2  引用标准 
    GB 4789.28  食品卫生微生物学检验  染色法、培养基和试剂 
3  设备和材料 
3．1  平天：称取检样用。 
3．2  均质器或乳钵。 
3．3  温箱：36±1℃，42℃。 
3．4  水浴：100℃，65～68℃，50℃。 
3．5  显微镜。 
3．6  离心机。 
3．7  酶标仪。 
3．8  细菌浓度比浊管：Mac Farland3 号。 
3．9  灭菌广口瓶：500 mL。 
3．10  灭菌三角烧瓶：500 mL，250 mL。 
3．11  灭菌平皿：90 mm×15 mm。 
3．12  灭菌试管：10 mm×75 mm。 
3．13  灭菌吸管：1 mL，5 mL。 
3．14  橡皮乳头。 
3．15  载玻片。 
3．16  酒精灯。 
3．17  灭菌金属匙或玻璃棒。 
3．18  接种棒，镍铬丝。 
3．19  试管架，试管篓。 
3．20  冰箱。 
3．21  注射器 0.25 mL，连接内径为 1 mm 塑料小管一段。 
3．22  灭菌的刀子、剪子、镊子。 
3．23  小白鼠：1～4 目龄。 
3．24  硝酸纤维素滤膜150  mm×50  mmΦ0.45  um。临用时切成两张，每张75  mm
×50 mm，用铅笔划格，每格 6 mm×6 mm，每行 10 格，分 6 行。灭菌备用。 
4  培养基和试剂 
4．1  乳糖胆盐发酵管：按 GB 4789.28 中 4.9 规定。 
4．2  营养肉汤：按 GB 4789.28 中 4.8 规定。 
4．3  肠道菌增菌肉汤：按 GB 4789.28 中 4.18 规定。 
4．4  麦康凯琼脂：按 GB 4789.28 中 4.24 规定。 
4．5  伊红美蓝琼脂（EMB）：按 GB 4789.28 中 4.25 规定。 
4．6  三糖铁琼脂（TSI）：按 GB 4789.28 中 4.26,4.27 规定。 
4．7  克氏双糖铁琼脂（KI）：按 GB 4789.28 中 4.28,4.29 规定。 
4．8  糖发酵管（乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇） ：按GB 4789.28中3.2规定。  
4．9  赖氨酸脱羧酶试验培养基：按 GB 4789.28 中 3.12 规定。 
4．10  尿素琼脂（pH7.2）；按 GB 4789.28 中 3.16 规定。 
4．11  氰化钾（KCN）培养基；按 GB 4789.28 中 3.16 规定。 
4．12  蛋白胨水、靛基质试剂：按 GB 4789.28 中 3,13 规定。 
4．13  半固体琼脂：按 GB 4789.28 中 4.30 规定。 
4．14  Honda 氏产毒肉汤：按 GB 4789.28 中 4.34 规定。 
4．15  Elek 氏培养基：按 GB 4789.28 中 4,35 规定。 
4．16  氧化酶试剂：按 GB 4789.28 中 3.18 规定。 
4．17  革兰氏染色液：按 GB 4789.28 中 2.2 规定。 
4．18  致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒
素大肠埃希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。 
4．19  产肠毒素大肠埃希氏菌 LT 和 ST 酶标诊断试剂盒。 
4．20  产肠毒素 LT 和 ST 大肠埃希菌标准菌株。 
4．21  抗 LT 抗毒素。 
4．22  多粘菌素 B 纸片：300IU，φ16 mm。 
4．23  0.1%硫柳汞溶液。 
4．24  2%伊文思蓝溶液。 
5  检验程序 
    致泻大肠埃希菌检验程序如下： 
 6  操作步骤 
6．1  增菌 
    样品采集后应尽快检验。 除了易腐食品在检验之前应预冷藏外， 一般不冷藏。
以无菌手续称取检验25 g，加在225 mL营养肉汤中，以均质器打碎1 min或用
乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其
余的移入500 mL广口瓶内，于36±1℃培养6 h。挑取1 环，接种于 1管30 mL
肠道菌增菌肉汤内，于 42℃培养 18 h。 
6．2  分离 
    将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美
蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平
板，于36±1℃培养18～24 h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也
要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。 
6．3  生化试验 
6．3．1  自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（TSI）或克氏双
糖铁琼脂（KI）。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2 尿素琼
脂、KCN 肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在 36℃培养过液。 
6．3．2  TSI 斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性和尿素阴性的培养物为大
肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均
非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。 
6．4  血清学试验 
6．4．1  假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希菌的琼脂培养物，用致病
性大肠埃希氏菌、 侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O 血清和出
血性大肠埃希氏菌 O157 血清做玻片凝集试验。当与某一种多价 O 血清凝集时，
再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。 致泻大肠埃希氏菌所包括的 O抗原
群见表 1。如与某一单价 O 血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。 
表 1   致泻大肠埃希氏菌所包括的 O 抗原群 
大肠埃希氏菌的种类  所包括的 O 抗原群 
EPEC 
O26  O55  O86  O111ab  O114  O119  O125ac  O127 
O128ab  O142  O158 
EHEC  O157 
EIEC 
O28ac  O29  O112ac  O115  O124  O135  O136  O143 
O144  O152  O164  O167 
ETEC 
O6  O6  O11  O15  O20  O25  O27  O63  O78  O85 
O114  O115  O26  O128ac  O148  O149  O159  O166 
O167 
6．4．2  证实试验：制备 O 抗原悬液，稀释至与 Mac Farland3 号比浊管相当的
浓度。原效价为 1：160～1：320 的 O 血清，用 0.5%盐水稀释至 1：40。稀释血
清与抗原悬液在 10 mm×75 mm 试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于
50℃水浴箱内，经 16 h 后观察结果。如出现凝集，可证实为该 O 抗原。 
6．5  肠毒素试验 
6．5．1  酶联免疫吸附试验检测 LT 和 ST。 
6． 5．1． 1  产毒培养： 将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于 0.6 mLCAYE
培养基内，37℃振荡培养过夜。加入 20000IU/mL 的多粘菌素 B0.05 mL，于 37
℃1 h，离心 4000 r/min15 min，分离上清液，加入 0.1%硫柳汞 0.05 mL，于 4℃保存待用。 
6．5．1．2  LT检测方法（双抗体夹心法） ： （1）包被：先在产肠毒素大肠埃希
氏菌 LT和ST 酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液 0.5 mL，混
匀后全部吸出于 3.6 mL 包被液中混匀，以每孔 100 uL 量加入到 40 孔聚苯乙烯
硬反应板中，第一孔留空作对照，于4℃冰箱湿盒中过夜。 （2）洗板：将板中溶
液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔
中残留液体。 （3）封闭：每孔加100 uL封闭液，于37℃水浴中1 h。 （4）洗板：
用洗涤液Ⅱ洗3 次，操作同上。 （5）加样本：每也分别加各种试验菌株产毒培养
液100 uL，37℃水浴中1 h。（6）洗板：用洗涤Ⅱ洗3次，操作同上。 （7）加酶
标抗体：先在酶标 LT 抗体管中加 0.5 mL 稀释液，混匀后全部吸出于 3.6 mL 稀
释液中混匀，每孔加100 uL，37℃水浴中1 h。 （8）洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，
操作同上。 （9）酶底物反应：每孔（包括第一孔）各加基质液 100 uL，室温下
避光作用5～10 min，加入终止液50 uL。 （10）结果判定：以酶标仪在波长492 
nm 下测定光度 OD 值，待测标本 OD 值大于阴性对照 3 倍以上为阳性，目测颜色
为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。 
6．5．1．3  ST 检测方法（抗原竞争法） ： （1）包被：先在包被用 ST 抗原管中
加0.5 mL包被液，混匀后全部吸出于 1.6 mL包被液中混匀，以每孔50 uL加入
于 40 孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻高敲板，使深布满孔底。第一孔留空
作对照， 置4℃冰箱湿盒中过夜。 （2） 洗板： 用洗涤液I 洗 3 次， 操作同一。 （3）
封闭：每孔加 100 uL 封闭液，37℃水浴 1 h。 （4）洗板：用洗涤Ⅱ洗 3 次，操
作同上。 （5） 加样本及ST 单克降抗体： 每孔分别加各试验菌株产毒培养液50 uL，
稀释的 ST 单克隆抗体 50 uL（先在 ST 单克隆抗体管中加 0.5 mL 稀释液，混匀
后全部吸出于1.6 mL稀释液中，混匀备用） ，37℃水浴1 h。96）洗板：用洗涤
液Ⅱ洗3次，操作同上。 （7）加酶标记兔抗鼠Ig复合物：称在酶标记兔抗鼠Ig
复合物管中加0.5 mL稀释液，混匀后全部吸出于 3.6 mL稀释液中混匀，每孔加
100 uL，37℃水浴1 h。 （8）洗板：用洗涤液Ⅱ洗 3次，操作同上。（9）酶底物
反应：每孔（包括第一孔）各加基质液 100 uL，室温下避光5～10 min，再加入
终止液50 uL。 （10）结果判定：以酶标仪在波长 492 nm 下测定吸光度（OD）值：  
              ×
−
值 阴性对照
值 待测样本 值 阴性对照
OD
OD OD ≥50%为阳性 
    目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。 
6．5．2  双向琼脂扩散试验检测 LT：将被检菌株按五点环形接种于 Elek 氏培
养基上。以同样操作，共做两份，于 36℃培养 48 h。在每株菌的菌苔上放多粘
菌素 B 纸片，于 36℃经 5～6 h，使肠毒素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5 mm
处的中央，按一个直径 4 mm 的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴
加 LT 抗毒素 30 uL，用已知产 LT 和不产毒菌株作对照，于 36℃经 15～20 h 观
察结果。 在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性， 无沉淀带有者为阴性。  
6．5．3  乳鼠罐胃试验检测 ST 
    将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内，于 36℃培养 24 h，以 3000 r/min
离心 30 min，取上清液经薄膜滤器过滤，加热60℃30 min，每1 mL滤液内加入
2%伊文思蓝溶液0.02 mL。 将此滤液用塑料小管注入1～4目龄的乳鼠胃内0.1 mL，
同时接种3～4 只， 禁食3～4 h后用三氯甲烷麻醉， 取出全部肠管， 称量肠管 （包
括积液）重量及剩余体得。肠管重量与剩余体重之比大于 0.09 为阳性，0.07～
0.09 为可疑。 
6．6  结果报告 
    综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。 
   附加说明： 
本标准由卫生部卫生监督司提出。 
本标准由江西省卫生防疫站负责起草。 
本标准主要起草人何晓青。 
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。    
   

 

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