又称：浇注平板法。先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如 1 ∶ 10 、 1 ∶ 100 、 1 ∶ 1000 、 1 ∶ 10000 …），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至 45 ℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
倒平板的两种方法
持皿法
⑴将若干无菌培养皿叠放在左侧，便于拿取。
⑵点燃煤气灯，将火焰调到适中（空气不要太大，以免气流过急）。
⑶倒平板时，先用左手握住锥形瓶的底部，倾斜锥形瓶，用右手旋松棉塞，然后用右手的小指和手掌边缘夹住棉塞并将它拔出（切勿将棉塞放在桌面上），随之将瓶口周缘在火焰上过一下（不可灼烧，以防爆裂，以杀死可能沾在瓶口外的杂菌)。然后将锥形瓶从左手传至右手中（用右手的拇指、食指和中指拿住三角瓶的底部），在这操作过程中瓶口应保持在离火焰2~3cm处，瓶口始终向着火焰。左手拿起一套培养皿，用中指、无名指和小指托住培养皿底部，用食指和大拇指夹住皿盖并开启一缝，恰好能让三角瓶伸入，随后倒出培养基。一般约倒入12ml的培养基即可铺满整个皿底。盖上皿盖，置水平位置等凝。然后再将三角瓶移至左手，瓶口再次过火并塞紧棉塞。
平板培养基的冷凝方法有两种，一种是将平板一个个摊开在桌面上冷凝，另一方法是将几个平板叠在一起冷凝。前者冷凝速度较快，在室温较高时采用；而后者冷凝速度较慢，可在室温较低时采用，其优点是形成冷凝水少，尤其适用于平板划线等的需要。
叠皿法
此法步骤与持皿法基本相同。不同点是左手不必持培养皿，而是将培养皿叠放在煤气灯的左侧并靠近火焰，用右手拿住三角瓶的底部，左手的掌背对着瓶口，用小指与无名指夹住瓶塞，将其拔出，随即使瓶口过火，同时用左手开启最上面的皿盖，倒入培养基，盖上皿盖即移至水平位置待凝。再依次倒下面的平板。在操作过程中，瓶口应向着火焰保持倾斜状，以防空气中微生物的污染。
