出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法

             出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法 
1主题内容与适用范围
2本标准规定了出口食品中蜡样芽孢杆菌的检验方法。
2　设备和材料
2.1　吸管：容量1.0mL和10.0mL,具0.1mL刻度。
2.2　菌落计数器。
2.3　均质器。
2.4　厌氧培养装置。
2.5　涡动搅拌器。
2.6 L形玻璃棒。
2.7　恒温培养箱: 30℃及36±1℃。
3　培养基和试剂
3.1　甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)。
3.2　胰酪胨大豆多粘菌素肉汤。
3.3　酚红葡萄糖肉汤。
3.4　硝酸盐肉汤。
3.5　营养琼脂。
3.6 L-酪氨酸营养琼脂。
3.7　溶菌酶营养肉汤。
3.8　改良V-P培养基。
3.9　动力培养基。
3.10 胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)。
3.11 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.12 亚硝酸盐试剂。
3.13 V-P试剂。
3.14 碱性复红染色液。
4　样品的保存和送检
待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。送达实验室后,应保存于4℃并
尽快进行检验。如在4d内不能进行检验,应将样品储存在-20℃,检验前再于室温下解冻。
　　脱水食品可在常温下送检和储存。
5　样品的制备
5.1　以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。称取50 g放于无菌均质杯中。
5.2　加450 mL无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000～20000 r/min均质2min。制成
1 : 10样品稀释液。
5.3　取1: 10稀释液10.0 mL加到含有90.0 mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中,充分混匀制
成1 : 100的稀释液。
5.4　每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管,按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10**-6。
6　检验步骤
6.1　平板计数法
6.1.1　取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂
表面。每稀释度接种两个MYP琼脂平板。
6.1.2　将平板置于30℃培养24 h。
6.1.3　选取具有15～150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板,进行计数。并计算同
一稀释度两个平板的平均菌落数。
　　蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色,环绕产生卵磷脂酶沉淀环。
如反应不典型,可继续培养24h再计数。
6.1.4　计数后,从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面,于30℃
培养24 h,按第6章进行证实试验。
6.1.5　根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的菌落数,按比例计算出该皿内的蜡样芽孢杆
菌菌落数,然后乘其稀释倍数再乘以10,即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告。
例:将检样10**-4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上,生成的可疑菌落数为25个,取5个进
行鉴定,证实为蜡样芽孢杆菌的是4个,则1 g样品中蜡样芽孢杆菌数为(25×4/5)×10**4
×10＝2×10**6。
6.2　最近似值(MPN)法
　　适用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于10**3个/g的食品。
6.2.1　选用三管法MPN系列。取10**-1、10**-2、10**-3三种稀释液,每种稀释液接种3
管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤,每管接种1mL。
6.2.2　置于30℃培养48±2 h。
6.2.3　从长菌的试管取培养物划线接种到MYP琼脂平板上。
6.2.4　置30℃培养24～48 h。
6.2.5　从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落,接种营养琼脂斜面,置30℃
培养24 h,供作证实试验。
6.2.6　根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的管数,由MPN表 [附录C(补充件)]计算蜡样芽
孢杆菌的MPN值/g,并作出报告。
7　证实试验
7.1　形态观察
取营养琼脂斜面培养物,作革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌,呈
短链或长链,芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端,不使菌体胀大。
7.2　生化学性状
7.2.1　葡萄糖发酵试验
　　接种于酚红葡萄糖肉汤中,厌氧条件下35℃培养24h。培养基应由红色变为黄色(表明
本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸)。
7.2.2　硝酸盐还原试验
　　接种于硝酸盐肉汤中,35℃培养24h。加硝酸盐试剂后应为阳性反应(红色)。
7.2.3 V-P试验
　　接种于改良V-P培养基中,35℃培养48 h。加V-P试剂及肌酸数粒,静止1h,应为阳性
反应(伊红色)。
7.2.4　L-酪氨酸分解试验
　　接种于L-酪氨酸琼脂培养基上,35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培养基应出现澄清
透明区(表示产生酪蛋白酶)。阴性时应继续培养72 h再观察。
7.2.5　溶菌酶试验
　　用直径2mm接种环取纯菌悬液一环,接种于溶菌酶肉汤中,35℃培养24h。该菌在本培
养基(含0.001％的溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应,应继续培养24 h。
7.2.6　卵磷脂酶试验
　　接种于MYP琼脂平板上,35℃培养24 h。阳性反应菌落周围应出现沉淀环(表示产生卵
磷脂酶)。
7.3　蜡样芽孢杆菌与类似菌的鉴别试验
7.3.1　动力试验
　　用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中,30℃培养24h。有动力蜡样芽孢杆菌
应沿穿刺线呈扩散生长,而蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长,形成所谓的蜂巢状扩散。也
可用悬滴法检查。蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌通常运动极为活泼,而炭疽杆菌则不运
动。
7.3.2　根状生长试验
　　用接种环取培养物接种于营养琼脂平板上,30℃培养18～24h。蜡样芽孢杆菌群的多
数菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落。其中唯独蕈状芽孢杆菌则形成根状生长
的特征。
7.3.3　溶血试验
　　取培养物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上,30～32℃培养24h。蜡样芽孢杆菌落周
围呈现β型完全溶血的溶血环。苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱的溶血现象,而
炭疽芽孢杆菌通常为不溶血。
7.3.4　蛋白质结晶毒素试验
　　取经30℃培养24h并于室温放置2～3d的营养琼脂培养物少许于载玻片上,滴加蒸馏
水混涂成薄膜。经自然干燥,微火固定后,于涂膜加甲醇半分钟后倾掉,再通过火焰干燥,
于载片上滴满0.5％碱性复红液,放火焰上加热微见蒸气(勿使染液沸腾)后持续1.5min,
移去火焰,使载片放置0.5min再倾去染液。用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检。观察
有无游离芽孢和染成黑色的菱形毒素结晶体。如发现游离芽孢形成的不丰富,应将培养
物置室温2～3d再行检查。苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性,而蜡样芽孢杆菌群的其
他菌种则为阴性。
7.3.5　结果解释及报告
　　符合蜡样芽孢杆菌群的特征,有活泼的动力,很强的溶血能力,不形成根状生长和不
产生蛋白结晶毒素,可报告为蜡样芽孢杆菌。
　　对偶尔遇到的一些少数可疑菌株,可以根据需要进行其他试验,如青霉素酶、噬菌
体试验等。
附　录 A
　　　　　　　　　　　　　　　 培 养 基 制 备
　　　　　　　　　　　　　　　　 (补充件)
A1 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基(MYP)
　　a. 　基础琼脂 
　　　 　牛肉膏　　　　　　　　　　　1.0g
　　　 　蛋白胨 10.0g
　　　 　D-甘露醇 10.0g
　　　 　氯化钠 10.0g
　　　 　琼　脂 15.0g
　　　 　酚　红 0.025g(配成溶液加入)
　　　 　蒸馏水　　　　　　　　　　 稀释至900mL
　　b. 50％卵黄液 50mL
　　c. 多粘菌素B 100 IU/mL
　　将a.中的前5种成分加入蒸馏水中加热溶解,校正pH至7.2±0.1,加入酚红溶液,混匀
后分装烧瓶中,每瓶225 mL。121℃高压灭菌15min。用时加热溶化,冷至50℃后每瓶加入
50％卵黄液12.5mL和2.5mL多粘菌素B溶液,混匀后倾注灭菌平皿,每皿15～18mL。用前应
将平板置室温约24 h。
　　注：①50％卵黄液：取鲜鸡蛋,用硬刷将蛋壳彻底洗净,沥干,放于70％酒精溶液中
浸泡1 h。以无菌操作取出卵黄,加入等量灭菌生理盐水,混匀后备用。
　　　 ②多粘菌素B溶液：在50mL灭菌蒸馏水中溶解500 000国际单位的无菌硫酸盐多
粘菌素B。
A2　胰酪胨大豆多粘菌素肉汤
　　　　胰酪胨 17.0g
　　　　植物胨　　　　　　　　　　 3.0g
　　　 氯化钠　　　　　　　　　　 5.0g
　　　 磷酸氢二钾　　　　　　　　 2.5g
　　　 葡萄糖　　　　　　　　　　 2.5g
　　　　蒸馏水　　　　　　　　　　　 稀释至1000mL
　　　　pH7.3±0.1
　　将上述各成分溶解在蒸馏水中,煮沸2min,分装大试管,每管15 mL,121℃高压灭菌
15min。临用时每管加入0.5％多粘菌素B溶液0.1mL混匀即可。
　　注：多粘菌素B溶液：在33.3mL灭菌蒸馏水中溶解500 000国际单位无菌硫酸盐多粘
菌素B。
A3　酚红葡萄糖肉汤
　　　 (月示)胨　　　　　　　　　　10.0g
　　　 牛肉膏　　　　　　　　　　 1.0g
　　　 氯化钠　　　　　　　　　　 5.0g
　　　 葡萄糖　　　　　　　　　　 5.0g
　　　 酚　红　　　　　　　　　　0.018g(配成溶液加入)
　　　 蒸馏水　　　　　　　　　　　稀释至1000mL
pH7.4±0.1
　　将除酚红外的各成分溶解于蒸馏水并稀释至1000mL。校正pH后加入酚红溶液,混匀,
分装试管,每管3 mL。121℃高压灭菌10min备用。最终pH7.4±0.1
A4　硝酸盐肉汤
　　　　牛肉膏　　　　　　　　　　 3.0g
　　　　蛋白胨　　　　　　　　　　　5.0g
　　　　硝酸钾　　　　　　　　　　　1.0g
　　　　蒸馏水　　　　　　　　　　　稀释至1000mL
　　　　pH7.0±0.1
　　将上述各成分溶解于蒸馏水并稀释至1000mL。校正pH后分装试管,每管5mL,121℃高
压灭菌15min。
A5　营养琼脂
　　　　牛肉膏　　　　　　　　　　　3.0g
　　　　蛋白胨　　　　　　　　　　　5.0g
　　　　琼 脂 稀释至1000mL
　　　　pH7.2±0.1
　　将各成分于蒸馏水中加热溶解。校正pH后分装试管,每管5～7mL；或分装烧瓶,每瓶
100～150mL。121℃高压灭菌15 min。将试管取出,制成斜面；如制平板,可将灭菌的琼
脂冷至45～50℃倾注灭菌平皿,每皿18～20mL。
A6 L-酪氨酸营养琼脂
　　　　营养琼脂 100mL
　　　　 5％灭菌L-酪氨酸悬液 10mL
　　将100mL营养琼脂溶化,冷至45℃,加入5％的灭菌L-酪氨酸悬液10mL,充分混匀后,
分装试管,每管3.5mL。制成的斜面应迅速冷却防止L-酪氨酸分离而出。
　　注：L-酪氨酸悬液：将0.5g酪氨酸加10mL蒸馏水混匀,121℃高压灭菌15min。
A7　溶菌酶营养肉汤
　　　　牛肉膏　　　　　　　　　　　3.0g
　　　　蛋白胨　　　　　　　　　　　5.0g
　　　　蒸馏水　　　　　　　　　　　稀释至1000mL
0.1%溶菌酶溶液 10.0mL
　　　　pH6.8±0.1
　　将上述成分(溶菌酶溶液除外)溶解于蒸馏水并稀释至1000mL。校正pH后,分装于烧
瓶中,每瓶99mL。121℃高压灭菌15min。于每瓶中加入0.1％溶菌酶溶液1mL,混匀后分装
灭菌试管,每管2.5mL。
　　注：溶菌酶溶液：在65mL灭菌的0.1mol/L盐酸中加0.1g溶菌酶。煮沸20min溶解后,
再用灭菌的0.1mol/L 盐酸稀释至100mL。
A8　改良 V-P培养基
　　　　(月示)蛋白胨　　　　　　　　 7.0g
　　　葡萄糖　　　　　　　　　　　 5.0g
　　　　氯化钠　　　　　　　　　　　 5.0g
　　　　pH6.5±0.1
　　将上述各成分溶解于蒸馏水并稀释至1000 mL。校正pH后分装试管,每管5mL。121℃
高压灭菌10 min备用。
A9　动力培养基
　　　　胰酪胨 10.0g
　　　　酵母膏　　　　　　　　　　　 2.5g
　　　　葡萄糖　　　　　　　　　　　 5.0g
　　　　磷酸氢二钠　　　　　　　　　 2.5g
　　　　琼　脂 3.0g
　　　　蒸馏水　　　　　　　　　　　 稀释至1000mL
　　　　pH7.4±0.2
　　将上述各成分于蒸馏水加热溶解并稀释至1000 mL。校正pH后,分装试管,每管2mL。
121℃高压灭菌10 min备用。
A10 胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)
　　　　胰酪胨 15.0g
　　　　植物胨　　　　　　　　　　　 5.0g
　　　　氯化钠　　　　　　　　　　　 5.0g
　　　　琼　脂 15.0g
　　　　蒸馏水　　　　　　　　　　　稀释至1000mL
　　　　pH7.0±0.2
　　将上述各成分于蒸馏水中加热溶解。校正pH后,分装烧瓶,每瓶100mL。121℃高压灭
菌15min。水浴中冷至45～50℃加入5mL无菌脱纤维羊血,混匀后倾注平板,每皿18～20mL。
　　　 　　　　　　　　　　　附　录 B　
　　　　　　　　　　　　　　试　剂　配　制
　　　　　　　　　　　　　　　 (补充件)
B1　Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液
　　在500mL蒸馏水中溶解磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g,用1mol/L氢氧化钠溶液约175mL校
正pH至7.2,再用蒸馏水稀释至1000 mL,制成储存液于冰箱中储存。取原液1.25mL,用蒸
馏水稀释至1000 mL。分装试管,每管90 mL,121℃高压灭菌15 min。
B2　亚硝酸盐试剂
　　a.　 试剂A：对氨基苯磺酸8.0g,溶解于5mol/L,乙酸1000 mL中。
　　b.　 试剂B：α-萘酚2.5g溶解于5mol/L乙酸1000 mL中。
B3　V-P试剂
　　a.　 5％α-萘酚溶液：取α-萘酚5.0g溶解于100 mL无水乙醇中。
b. 40％氢氧化钾溶液：将氢氧化钾40 g于蒸馏水中溶解并稀释至100 mL。
　　c. 肌氨酸结晶。
B4　碱性复红染色液
　　取碱性复红0.5g溶解于20mL乙醇中,再用蒸馏水稀释至100mL,滤纸过滤后储存备用。
　　　  
   

 

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