基本原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈俞大，MIC俞小。
1. 从琼脂平板挑取形态相似的纯培养菌落接种肉汤培养基，并于35度培养至浊度达到或超过0.5麦氏单位，取出用盐水或肉汤调节菌液浓度至0.5麦氏单位，含菌量约（1－2）×108cfu/ml。也可将菌落直接悬浮于无菌盐水或肉汤内，调至0.5麦氏单位，这称为直接菌悬液法。
2. 用无菌棉拭子浸入调好的菌悬液中，将多于菌悬液在管壁挤出，在M-H琼脂平皿上划线，划满整个琼脂表面，旋转平皿60°重复划线共三次，最后一次用拭子涂抹琼脂边缘。置室温3－5分钟。
3.用纸片分配器或无菌镊子取药敏纸片，贴于平板表面，并用镊尖轻压一下纸片，使其贴平。每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm，90mm直径的平板适宜贴6张药敏纸片。
4. 将贴好纸片的平板置35度孵育18－24h后，用游标卡尺量取抑菌圈直径。
结果判断
根据抑菌圈的大小（不同抗生素其抑菌圈大小的标准不一致），判断为敏感（S），耐药（R）或中介度（I）。
某些细菌可蔓延生长至某种抗生素的抑菌圈内，如磺胺药抑菌圈内可能有微量的细菌生长，可忽略不计，应以外圈为准。
M-H琼脂培养基
根据商品无水M-H琼脂干粉要求制备，高压后平衡温度至45－50度时倾注平皿，使表面呈水平，琼脂厚度为4mm，pH值应在7.2－7.4间，表面应保持湿润，但不能有水滴。
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