蛋白胨提供氮源；乳糖是选择性碳源，提供能量，同时产酸引起菌体所带电荷和培养基酸碱度的变化；磷酸氢二钾一方面作为缓冲体系来缓解细菌分解乳糖产酸使pH下降的趋势，另一方面为细菌的生长提供K+、PO43+；琼脂粉为凝固剂。
大肠杆菌分解乳糖产酸，菌体带正电，与伊红结合染上红色，伊红与美蓝结合使菌落带上紫黑色并有金黄色金属光泽。
产气肠杆菌也利用乳糖产酸，但其产生的酸可以继续被分解为醇、醛、酮等，使pH上升，所以它在前期积累少量酸，使菌落结合了一定的伊红美蓝，继续培养后pH上升，所以其菌落为浅红色，很少有金属光泽。
不分解乳糖的细菌，如沙门氏菌和志贺氏菌，为无色或琥珀色半透明菌落。
