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2005年版药典三部部分附录


录入时间:2006-6-26 9:14:29 来源:其它

   
    2005年版药典三部部分附录

1.无菌检查法(修订)
2.支原体检查法(增修)
3.病毒外源因子检查法(修订)
4.热原质检查法(修订)
5.细菌内毒素检查法(修订)
6.崩解时限检查法(新增)
7.融变时限检查法(新增)
8.最低装量检查法 (新增)
9.装量(片重)差异检查法(新增)
10.粒度检查法 (新增)
11.抗毒素F(ab)2测定法(修订)
12.絮状单位测定法(新增)
13.A群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖分子大小测定法(增修)
14.伤寒Vi多糖分子量大小测定法(新增)
15.乙醇残留量测定法(康卫氏扩散皿法)(新增)
16.蛋白质含量测定(双缩脲法)(新增)

无菌检查法
无菌检查法系指用微生物培养法检查生物制品是否无菌的一种方法。
无菌检查应在洁净度为10000级环境中的局部洁净度100级、单向流空气区域内或无菌隔离系统中进行,其全过程应严格遵守无菌操作,防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及无菌隔离系统必须进行洁净度验证。
各种生物制品的无菌检查,均应按照本附录的规定进行,有专门规定者除外。
1 仪器
1.1 取样用灭菌注射器,5、10ml(供直接接种法用)。
1.2 全封闭式集菌培养器,滤膜孔径不大于0.45μm,膜直径约50mm (供薄膜过滤法用)。
1.3 普通显微镜(细菌镜检用)。
2 培养基及其制备方法
培养基应适合需氧菌、厌氧菌或真菌的生长,可按以下处方制备,亦可使用按该处方生产的符合规定的干粉培养基。
2.1 需氧菌、厌氧菌培养基1(流体硫乙醇酸盐1,用于培养需氧菌、厌氧菌)
胰酪蛋白胨(或酪素胰酶消化液,以总氮计2000mg) 15g
酵母浸出粉(或酵母透析液200ml) 5g
葡萄糖 5g
氯化钠 2.5g
L-胱氨酸(或半胱氨酸盐酸盐) 0.5g
硫乙醇酸钠(或硫乙醇酸) 0.5g(0.3ml)
琼脂 0.65~0.75g
刃天青 0.01g
水 1000ml
除葡萄糖和刃天青外,取上述成分加入水中,微温溶解后,调节pH为弱碱性,煮沸,滤清,加入葡萄糖和刃天青,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.1±0.2。
在供试品接种前,培养基氧化层的颜色(红色)不得超过培养基深度的1/3,否则,须经水浴煮沸加热20分钟,迅速冷却。只限加热一次,并防止被污染。
2.2 需氧菌、厌氧菌培养基2 (流体硫乙醇酸盐培养基2)
按需氧菌、厌氧菌培养基1处方,删除琼脂,取其余成分,如法配制,即得。
2.3改良马丁培养基(用于培养需氧菌、真菌)
蛋白胨 5g 
酵母浸出粉 (或酵母透析液200ml) 2g
葡萄糖 20g 
磷酸氢二钾 1g
硫酸镁 (MgSO4 ·7H2O) 0.5g 水 1000 ml
0.1%虎红 2 ml
除葡萄糖外,取上述成分加入水内,微温溶解后,调节pH值约为6.8,煮沸,加葡萄糖溶解后,摇匀,滤清,调节pH值使灭菌后为6.4±0.2。
2.4 营养琼脂培养基
蛋白胨 10g
牛肉浸粉 5g
氯化钠 5g
琼脂 14g
水 1000ml
取上述成分加入水中,微温溶解后,调节pH值为弱碱性,煮沸,滤清,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2。
上述培养基一般分别按10 ml、40 ml、100 ml或200 ml分装于试管或其他容器中,装量为试管或容器高度的2/5,均以115℃灭菌30分钟。细菌培养基经30-35℃培养3天,改良马丁培养基经20-25℃培养3-5天后,应无菌生长。合格的培养基使用期限不得超过一周。
3 培养基灵敏度检查
3.1 菌种 由国家药品检定机构分发。
3.1.1 需氧菌 乙型溶血性链球菌(CMCC 32210株),短芽孢杆菌(7316株)。
3.1.2 厌氧菌 生孢子梭状芽孢杆菌(CMCC 64941株)。
3.1.3 真菌、白色念珠菌(ATCC 10231)
3.2 菌液制备
将乙型溶血性链球菌、生孢子梭状芽孢杆菌、短芽孢杆菌分别接种于被检的培养基,经30~35℃培养一定时间 (乙型溶血性链球菌和生孢子梭状芽孢杆菌培养24~48小时,短芽孢杆菌培养18~20小时)后,将乙型溶血性链球菌和短芽孢杆菌分别刮入0.9%无菌氯化钠溶液内制成均匀菌液;生孢子梭状芽孢杆菌先将菌液吸入灭菌的试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌液;白色念珠菌接种在改良马丁培养基上,置20~25℃培养2-3天后,刮入0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌液。再将以上菌液稀释至与标准比浊管(由国家药品检定机构分发)相同之浓度,然后用0.1%蛋白胨水作10倍系列稀释, 分别制成10-8乙型溶血性链球菌菌液,10-7的短芽孢杆菌菌液、10-7生孢子梭状芽孢杆菌菌液及10-6白色念珠菌菌液。
3.3 培养基接种
将10-7的短芽孢杆菌、10-7生孢子梭状芽孢杆菌、10-8乙型溶血性链球菌和10-6 白色念珠菌菌液各1 ml分别接种到每管9 ml被检培养基中,(用于厌氧菌的培养基在试管中装量高度不得低于7cm)。每种菌液至少接种3管,并用未接种的培养基做对照,将接种乙型溶血性链球菌、生孢子梭状芽孢杆菌的培养基置30~35℃培养3天,接种短芽孢杆菌的培养基置30~35℃培养5天,接种白色念珠菌的培养基置20~25℃培养5天,记录结果。
3.4 结果判定
接种后培养基管数有2/3以上呈现生长,则判为该培养基的灵敏度合格。
培养基灵敏度:乙型溶血性链球菌(32210株)应达到10-8,短芽孢杆菌(7316株)和生孢子梭状芽孢杆菌(64941株)应达到10-7,白色念珠菌(ATCC 10231 株)应达到10-6。
3.5 附注
3.5.1 不应在同一洁净室内同时操作两个菌株。
3.5.2 无菌检查用培养基应每批进行灵敏度检查,合格后方可使用。
3.5.3 各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌检查用培养基的灵敏度。国家药品检定机构应定期抽检各生产单位的无菌检查用培养基。
4 各种培养基的采用
4.1 检查需氧性和厌氧性杂菌,应采用流体硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐剂制品中的需氧性和厌氧性杂菌时,该培养基中可不加硫乙醇酸盐。
4.2 检查真菌和腐生菌时,应采用真菌培养基。
4.3 检查混浊制品时,可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。检查活疫苗时,可适当增加琼脂含量,做成斜面。
5 抽样量及抽检瓶数
5.1 原液及半成品
除半成品除菌后需立即分装、留样作无菌检查的制品外,原液及半成品应每瓶(罐)分别进行无菌检查,其抽样量应至少为0.1%,但不得少于10ml。原液及半成品每开瓶一次,应如上法抽验。体外用诊断制品半成品每批取样至少3ml。
5.2 成品
每亚批均应进行无菌检查,供试品应随机抽取,应具有代表性(包括分装过程的前、中、后供试品或冻干过程不同层冻干柜中的供试品)。成品抽验量分出厂制品抽验量和上市制品监督抽验量两种。
5.2.1 出厂制品抽验量
5.2.1.1 分装量在100支(瓶)或以下者抽检不少于5支,101~500支(瓶)者抽检不少于10支(瓶),501~10000支(瓶)者抽检不少于20支(瓶),10001支(瓶)以上者抽检40支(瓶)。
5.2.1.2 每瓶装量在20ml以上的冻干血液制品,每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶,200瓶及以上者抽检4瓶。每瓶装量6~20ml抽检数量加倍。5ml和5ml以下者按5.2.1.1项抽检。
5.2.2 上市制品监督抽验量
5.2.2.1 除血液制品外,其他生物制品每批抽检8支(瓶)。
5.2.2.2 血液制品每瓶装量在50ml以下,抽检6瓶,50ml或50ml以上抽2瓶。
 
表  每支(瓶)注射剂抽验量 
每支(瓶)制品装量 
(ml) 
 <0.5 
 0.5≤V<5 
 5≤V<20 
 20≤V<100 
 
每支(瓶)抽验量 
(ml) 
 全量 
 0.5 
 1.0 
 5.0 
 

6 检查法
无菌检查法包括直接接种法及薄膜过滤法。如供试品性状允许,可优先采用薄膜过滤法。
6.1 直接接种法
6.1.1 含防腐剂的制品,应先增菌。按5. 2项抽取的供试品按上表逐瓶取样,并按每20支安瓿混合后接种。应接种培养基瓶数依供试品混合量(全部接种)而定。接种量与培养基的比例:用苯酚或氯仿作防腐剂者至少为1∶20,用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为1∶50。将混合供试品先按此比例接种于流体硫乙醇酸盐培养基1 内增菌,增菌培养基不得少于200ml(扁瓶)。于20~25℃培养3~4天后移种至流体硫乙醇酸盐培养基1、适宜的营养琼脂斜面、改良马丁培养基各2管,每管0.5 ml。将流体硫乙醇酸盐培养基1、适宜的营养琼脂斜面各1管置30~35℃培养,其余各管置20~25℃培养,增菌管及移种管培养时间全程不得少于14天。
6.1.2 不含防腐剂制品,不经增菌。按5.2项及上表将每批(或亚批)抽检供试品逐瓶取样混合,装量在5.0ml以下者(包括5.0ml)每10瓶(安瓿)混合,装量在5.0ml以上者每7瓶(安瓿)混合,应接种培养基管数依供试品混合量(全部接种)而定。将混合后的供试品直接接种于流体硫乙醇酸盐培养基1及改良马丁培养基培养基,接种后的流体硫乙醇酸盐培养基总数的1/2置30~35℃培养,其余置20~25℃培养,同时以0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品,做阴性对照,培养时间不得少于14天。
6.1.3 供试品混浊和接种后不能判定结果的制品,可按上表取规定量的供试品,接种于流体硫乙醇酸盐培养基2 (200ml)内进行增菌培养,3~4天后移种。培养基种类和管数、培养温度同6.1.1项,增菌管及移种管培养时间全程不得少于14天,然后判定结果。
6.1.4 体外诊断制品
只做半成品无菌检查。即半成品在加防腐剂之前,除菌过滤时留样做无菌检查,用直接接种法,培养8天,观察结果。如有菌生长,制品需经除菌处理后再做无菌检查,若再有菌生长应废弃。如半成品已加入防腐剂后除菌,则应留样按含防腐剂制品用直接接种法作无菌检查。
6.2 薄膜过滤法
采用全封闭式集菌器,薄膜孔径不大于0.45μm,膜直径约50mm。
取规定抽检供试品数,(如供试品少于10ml,则先用100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液或无菌稀释液稀释,)立即在无菌条件下导入无菌薄膜过滤器内,加压或减压过滤。含汞类防腐剂的供试品,在供试品过滤后,用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的无菌溶剂冲洗滤膜3次,每次100ml。过滤后,两个滤器加流体硫乙醇酸盐培养基1 各100ml,另一个滤器加改良马丁培养基100ml。一个硫乙醇酸盐培养基的滤器置30-35℃培养,其余置20-25℃培养,同时以0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品做阴性对照。培养时间不少于14天。
6.3 结果判定
6.3.1 无菌生长判为合格(有专门规定者除外)。
6.3.2 发现有菌生长,可复试。复试供试品量应加倍,无菌生长判为合格。若复试仍有菌生长,该制品判为不合格。
6.3.3 成品无菌检查不合格的亚批数占整批的30%以上时,由质量保证部门会同有关部门根据具体情况,全部或部分废弃。
附注:冻干制品应按使用说明书或标签规定的溶解液重溶后进行无菌检查。
修订说明:此附录在现行版‘无菌试验规程’的基础上,参考《中国药典》‘无菌检查法’及WHO相关规程进行了修订,并对全文进行了重新组合。原规程中‘支原体检查’部分另写成为独立的附录。

支原体检查
本法系采用培养法和指示细胞法(DNA染色法)对主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查,上述两种方法应同时进行。病毒类疫苗的病毒收获液、原液或成品的支原体检查采用培养法,必要时,亦可采用指示细胞法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。
1 培养法
1. 1 仪器
适宜规格的培养箱
普通显微镜
1.2 培养基种类及处方
1.2.1 肺炎支原体肉汤培养基
猪胃消化液 500ml
牛肉浸液 500ml
酵母浸粉 5 g
氯化钠 2.5g
葡萄糖 5g
酚红 0.02g
将上述成分混合溶解,于121℃高压灭菌15分钟。使用时,于80ml内加入:
青霉素G溶液(10万U/ml) 1.0ml
1%醋酸铊溶液 2.0ml
无支原体马血清 20ml
最终pH值 7.6±0.2
1.2.2 精氨酸支原体肉汤培养基
猪胃消化液 500ml
牛肉浸液 500ml
酵母浸粉 5 g
氯化钠 2.5g
葡萄糖 5g
L-精氨酸 2g
酚红 0.02g
将上述成分混合溶解,于121℃高压灭菌15分钟。使用时,于80ml内加入:
青霉素G溶液(10万U/ml) 1.0ml
1%醋酸铊溶液 2.0ml
无支原体马血清 20ml
最终pH值 7.1±0.2
1.2.3 支原体半固体培养基
将2.1.1.1培养基中酚红去掉,加入3g琼脂即为半固体培养基。
1.2.4 支原体琼脂培养基
将2.1.1.1培养基中酚红去掉,加入13-15g琼脂即为支原体琼脂培养基。
1.3 支原体检查用培养基灵敏度检查(变色单位试验法)
1.3.1 菌种
肺炎支原体(ATCC 1533株),口腔支原体(ATCC 23714株)。由国家药品检定机构分发。
1.3.2 培养基
凡应用于检查支原体的培养基都应进行变色单位试验。
1.3.3 操作
凡操作支原体应在专门的无菌操作室内进行。
将菌种接种于被检的支原体培养基,经35~37℃培养至培养基变色,盲传两代后,将培养物接种到被试培养基中,作10倍系列稀释,肺炎支原体稀释至10-7~10-9,接种在肺炎支原体肉汤培养基内;口腔支原体稀释到10-3~10-5 ,接种在精氨酸支原体肉汤培养基内,每个稀释度3支试管,置35~37℃培养7~14天观察培养基变色结果。
1.3. 4 结果判定
以接种稀释后培养基管数的2/3以上呈现生长变色的最高稀释度为变色单位判定标准。
培养基的灵敏度:肺炎支原体(ATCC1533株)变色单位应达到10-8,口腔支原体(ATCC23714株)应达到10-4。
附注:质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。
1.4 供试品检查
1.4.1 抽样量
按“无菌检查法”进行。应对半成品按亚批抽样检查,成品可不再做。
1. 4. 2 方法及步骤
供试品如在24小时以内进行支原体检查者可贮存于2~8℃;超过24小时才能接种者,供试品应在-20℃以下贮存。
检查支原体采用支原体半流体和液体培养基。半流体培养基在使用前煮沸10~15分钟,冷却至56℃左右,加入未灭活马血清或灭活小牛血清和酵母浸液(培养基∶血清∶酵母浸液为7∶2∶1),并可酌情加入适量青霉素或醋酸铊,充分摇匀。液体培养除无需煮沸外亦应同样补加上述成分。
将供试品0.5~1.0ml分别种入每支10ml半流体(已冷至35~37℃)和10ml液体培养基中,每种培养基接种4支,置35~37℃培养21天。于接种后的第7天取4支中的2支进行次代培养,每一培养基转种半流体及液体培养基各2支,置35~37℃下培养21天,每隔3天观察一次。
1.4.3 结果判定
在培养结束时,如已接种的培养基均无支原体生长,则供试品为合格;如有支原体生长,可用两倍的接种量和培养基进行重试,如无支原体生长,供试品为合格,如仍有支原体生长,供试品判为不合格。
2.指示细胞培养法(DNA染色法)
供试品接种于指示细胞(无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞)培养后,用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体,则附在细胞表面的支原体DNA着色,在荧光显微镜下可判定。
2.1 仪器
适宜规格的荧光显微镜
适宜规格的二氧化碳孵箱
六孔细胞培养板或其他容器
2.2.培养基及指示细胞
DMEM完全培养基
DMEM无抗生素培养基
指示细胞(已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞)
2.3 试剂
2..3.1 二苯甲酰胺荧光染料(Hoechst 33258)浓缩液:
称取5 mg二苯甲酰胺荧光染料加入100 ml 不含酚红和碳酸氢钠的 Hank’s平衡盐溶液中,在室温下用磁力搅拌30~40分钟,使完全溶解,避光-20℃保存。
2.3.2 二苯甲酰胺荧光染料工作液
取1 ml上述浓缩液,加至100ml无酚红和碳酸氢钠的Hank’s溶液中。
2.3.3 固定液
乙酸:甲醇(1:3)溶液为细胞固定液。
2.3.4 封片液
0.1mol/L柠檬酸 22.2ml
0.2mol/L Na2HP4·12H2O 27.8ml
甘油 50.0ml
以上三者混匀,调pH 至5.5。
2. 4供试品检查
2.4.1 供试品的处理
2.4.1.1 细胞培养物:将待检细胞经无抗生素培养基传三代,然后取细胞已长满的且三天未换液的细胞培养上清液,待检。
2.4.1.2 毒种悬液:如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时,应用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。
2.4.1.3 其他供试品:应选用该供试品对细胞生长无影响的细胞作为指示细胞进行检查。
2.4.2 指示细胞的制备
取成片Vero细胞消化后,制成1 x105个/ml的细胞悬液,每孔0.5ml接种6孔细胞培养板或其他容器,每孔加无抗生素培养基3 ml,于5% 二氧化碳孵箱 37℃培养过夜。
2. 4. 3 方法及步骤
于指示细胞培养板中依次加供试品、阴性对照及阳性对照包括;
阴性对照加无抗生素培养基2ml;
阳性对照可选已知阳性的供试品标准菌株;
待检细胞培养上清液2ml;
或毒种或其他供试品至少1ml。
5% 二氧化碳孵箱 37℃培养3~5天。
指示细胞培养物至少传代1次;末次传代培养用含盖玻片的6孔培养板培养3~5天。
取出培养板,吸出培养孔中的培养液,加入固定液5ml,放置5分钟。
吸出固定液,再加5ml固定液固定10分钟。
吸出固定液,使盖玻片在空气中干燥。
加 Hoechst 33258 染料(或其他DNA染料)工作液5ml,加盖,室温下放置30分钟。
吸出染液,每孔加5 ml 蒸馏水,洗3次。
吸出蒸馏水,盖玻片于空气中干燥。
取洁净载玻片加封片液一滴,分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。
2. 4. 4 结果判定
2.4.4.1 阴性结果:仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。
2.4.4.2 阳性结果:荧光显微镜下细胞外可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。
当阴性及阳性对照结果均成立时,试验有效。
如未证明供试品有支原体存在,则供试品为合格;如发现供试品为阳性或可疑时,应进行重试;如仍阳性时,供试品判为不合格。

修订说明:此附录在现行版‘无菌试验规程’的基础上,参考WHO相关规程进行了修订,并对全文进行了重新组合,并成为独立附录。


病毒外源因子检查法
病毒类制品在毒种选育和生产过程中,经常使用动物或细胞培养基质,所以,有可能造成外源因子(特别是外源病毒因子)的污染。为了保证产品质量,需要对毒种和细胞进行外源因子的检测。
A. 病毒种子批外源因子检查
对病毒主种子批或工作种子批,应取样进行病毒外因子检测,其取样量应足够检测试验的需要。在试验前应用非人和非猴源的特异性抗体,中和本病毒。所用抗体应用与生产疫苗(或制品)不同种的无外源因子污染的细胞(或动物)制备的免疫原生产的抗血清(或单克隆抗体)。如果病毒曾在禽类组织或细胞中繁殖过,则抗体不能用禽类来制备。若用鸡胚,应来自SPF鸡群。
1. 动物试验法
1.1小鼠。取15~20g小鼠至少10只,用经中和后的病毒悬液,每只脑内接种0.03ml,腹腔接种0.5ml。至少观察21天。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠,为了检查病毒感染的证据,直接肉眼观察其病理改变,并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只小鼠并观察21天。如果没有小鼠表现出病毒感染现象,则病毒种子批符合要求。在观察期内至少有80%最初接种的小鼠存活试验才有效。
1.2乳鼠。出生后24小时以内的乳鼠,至少10只,用经中和后的病毒悬液,脑内接种0.01ml,腹腔接种至少0.1ml。每天观察,至少14天。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠,直接肉眼观察其病理改变,并取有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液脑内和腹腔接种另外至少5只小鼠并每天观察,观察14天。如果没有小鼠表现出有病毒感染现象,该种子批通过试验。在观察期内至少有80%最初接种的小鼠存活试验才有效。
2. 细胞培养法
2.1非血吸附病毒检查
中和后的病毒悬液,还应分别接种于人源、猴源和生产用的同种不同批的细胞。如果是利用人二倍体细胞生产的,还应接种另外一株人二倍体细胞。每种细胞最少接种6瓶,每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25%。于36±1℃培养,观察二周,或最后一次收获病毒液时间检查是否有CPE出现。未见CPE为阴性。
2.2血吸附病毒检查
于第6~8天和第14天,每种细胞分别各取出2瓶进行血吸附病毒检查。用0.2%~0.5%豚鼠红细胞悬液覆盖于细胞表面,一瓶放2~8℃,一瓶放20~25℃,30分钟后显微镜下观察,未见血球吸附现象为阴性。
3.鸡胚检查法
在禽类组织或细胞中繁殖过的病毒种子需用鸡胚检查禽类病毒的污染。选用9~11和5~7日龄SPF鸡胚最少每组5只,分别于尿囊腔和卵黄囊途径接种每胚0.5ml经过中和后的病毒悬液。孵育7日后,取尿囊液用豚鼠和鸡红细胞做血球凝集试验应为阴性。被接种的鸡胚至少80%存活7天试验有效。
B. 生产用对照细胞外源因子检查
1.非血吸附病毒检查
1.1细胞直接观察
每批生产用细胞应留取5%(不少于500ml),分种于若干培养瓶中,加入与疫苗生产相同的细胞维持液,在与疫苗生产相同的条件下培养,观察14天,在显微镜下观察,是否有CPE出现,无CPE出现者为阴性。在观察期末至少要80%的对照细胞培养物存活试验成立。
1.2细胞培养试验
对照细胞在观察期末,收取上清液混合后取适量接种于猴源和人源的细胞培养物,如果疫苗病毒在非猴或非人源其他细胞系上生产,还应接种于同种不同批细胞。接种量应不少于总量的25%。每种细胞至少检查5ml上清混合液。在36±1℃培养,如生产的细胞培养条件不是36±1℃,则应选用与生产相同的培养条件进行。并连续观察14天,或最后到收获液的时间仍无CPE者为阴性。
2.血吸附病毒检查
对1.1、1.2细胞培养物在观察期末取至少25%的细胞培养瓶进行血吸附病毒检查。(方法见A.2.2项)

修订说明:此规程根据欧洲药典(2000版)修订。

热原质检查法
本法系将一定剂量的供试品,静脉注入家兔体内,在规定时间内,观察家兔体温升高的情况,以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
1 供试用家兔 
1.1 供试用的家兔应健康合格,体重1.7~2.5kg, 雌兔应无孕。
1.2 预测体温前7日即应用同一饲料饲养,在此期间内,体重应不减轻,精神、食欲、排泄等不得有异常现象。
1.3 未曾用于热原质试验的家兔,应在检查供试品前3~7日内预测体温,进行挑选。挑选试验的条件与检查供试品时相同,仅不注射药液,每隔30分钟测量体温1次,共测8次,8次体温均在38.0~39.6℃的范围内,且最高与最低体温差不超过0.4℃的家兔,方可供热原质试验用。
1.4 凡热原质试验用过的家兔,若供试品判为符合规定,家兔至少休息48小时后可重复使用。对血液制品、抗毒素和其他同一过敏原的供试品在5天内可重复使用。
2 试验前准备 
2.1 试验用的注射器、针头及一切与供试品接触的器皿,应置烘箱中用250℃加热30分钟或用180℃加热2小时,也可用其他适宜方法除热原质。
2.2 测温探头的精密度应为±0.1℃。探头插入肛门的深度和时间各兔应相同,深度一般约6cm,时间不得少于2分钟。
2.3 热原质试验前1~2日,供试验用家兔应尽可能处于同一温度的环境中,实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃,实验室温度应在17~25℃,试验全过程室温变化不得大于3℃,并应保持安静,避免强光照射,避免引起动物骚动(包括噪声干扰)。空气中氨含量应低于20mg/L。
3 试验
3.1 供试品
供试品或稀释供试品的无热原质注射液,在注射前应预热至38℃。供试品的注射剂量见各制品规程的规定。但家兔每1kg体重注射体积不得少于0.5ml,不得大于10ml。
3.2 每批供试品初试用3只家兔,复试用5只家兔。
3.3 家兔在试验前至少2小时开始停止给食并置于适宜装置中,直至试验完毕。家兔固定30~60分钟后开始检温,间隔30分种测量体温1次,一般测量2次,两次体温之差不得超过0.2℃,以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔,正常体温应在38.0℃~39.6℃的笵围内,同组兔间正常体温之差不得大于1℃。
3.4 测定其正常体温后15分钟以内,自耳静脉缓缓注入规定剂量并预热至38℃的供试品溶液,然后每隔30分钟测量其体温一次,连测6次。
3.5 若第6次较第5次升温超过0.2℃并超过正常体温时,应连续测量,直至与前一次相比升温不超过0.2℃。
4 结果判定
每只兔的正常体温与注射供试品后最高升温之差,为该兔的应答。出现负值以零计算。
4.1 初试结果判定
4.1.1 符合下列情况者,判为合格:
3只家兔体温升高均低于0.6℃,并且3只家兔体温升高总和不超过1.4℃。
4.1.2 有下列情况之一者,复试一次:
3只家兔中,有1只家兔体温升高0.6℃或0.6℃以上;或3只家兔体温升高总和超过1.4℃。
4.2 复试结果判定
4.2.1 符合下列情况者,判为合格:
初、复试的8只家兔中,2只或2只以下家兔体温升高0.6℃或0.6℃以上,并且升温总和不超过3.5℃。
4.2.2 有下列情况之一者,判为不合格:
初、复试8只家兔中,2只以上家兔体温升高0.6℃或0.6℃以上;或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和超过3.5℃。

热原质检查法修订说明
参考《中国药典》二部附录Ⅺ D《热原检查法》对《生物制品热原质试验规程》做如下修订:
1、题目修订
《生物制品热原质试验规程》→《热原质检查法》(同《中国药典》二部);
1、试验用的家兔
1.1项 试验用家兔的体重未变:1.7~2.5 kg;
1.3项 予检温时间:1~3日→3~7日(同《中国药典》二部);
1.3项 检温间隔时间:60分钟,共测4次体温→30分钟,共测8次体温(同《中国药典》二部);
1.3项 各兔最高与最低温度差异:38.0~39.8 ℃→38.0~39.6 ℃;
1.3项 “最高与最低体温差不超过0.5 ℃”→“最高与最低体温差不超过0.4℃”;
2、试验前准备
2.2项 增加“探头插入肛门的深度和时间各兔应相同,深度一般约6cm,时间不得少于1分钟。” (同《中国药典》二部);
2.3项 增加“实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃”
2.3项 “避免噪声干扰”→“避免引起动物骚动(包括噪声干扰)”(参考〈欧洲药典〉);
3、试验
3.3项 “家兔在试验前2小时以上开始停止给食……”→“家兔在试验前至少2小时开始停止给食……” ;
3.3项 检温“间隔30~60分钟”→“间隔30分钟”;
3.3项 增加“当日使用的家兔,正常体温应在38.0℃~39.6℃的笵围内,” 的要求(同《中国药典》二部)。
4、结果判定
维持生物制品规程的表达方式。温度的有效数字位数与《中国药典》二部一致:小数点后一位。
5、保留生物制品热原质试验的特色和我们的经验,如家兔使用次数,注射供试品的体积限制,实验室的温度等。
表:生物制品热原质试验规程修订情况
        
  
 《中国药典》
二部
 生物制品规程
 《中国药典》
三部
 修订理由
 
1.1家兔体重(kg )
 1.7~3.0
(中年兔)
 1.7~2.5
 1.7~2.5
 注射量问题
1.7~2.5 kg的家兔为青年兔;敏感;
 
1.3予检温时间
 试验前3~7日
 试验前1~3日
 试验前3~7日
 2周内无变化,与〈中国药典〉二部一致。
 
1.3检温间隔时间
 30分钟,共测8次体温
 60分钟,共测4次体温
 30分钟,共测8次体温 
 试验更精细,与〈中国药典〉二部一致
 
1.3予检温各兔体温范围
 38.0~39.6 ℃
 38.0~39.8 ℃
 38.0~39.6 ℃ 
 与〈中国药典〉二部一致
 
1.3予检温各兔最高与最低温度差异
 不超过0.4 ℃
 不超过0.5 ℃
 不超过0.4 ℃ 
 家兔体温波动小,家兔稳定 。
 
2.2探头插入肛门的深度和时间
 各兔应相同,深度一般约6cm,时间不得少于1分钟。 
  
 无要求
 各兔应相同,深度一般约6cm,时间不得少于1分钟。 
  
 应该有要求,与〈中国药典〉二部一致。
 
2.3实验室和饲养室的温度差
 不得大于5℃
 无要求
 不得大于5℃ 
 严格试验条件,与〈中国药典〉二部一致。
 
2.3实验室温度
 17℃~28℃ 
 15℃~25℃
 15℃~25℃ 
 室温超过28℃家兔不长体重;
USP规定:20~23℃;
 
2.3噪声干扰
 避免噪音干扰 
 噪声干扰
 避免引起动物骚动(包括噪声干扰) 
 参考〈欧洲药典〉,此种表达方式更合理。 
  
 
3.3试验前检温时间间隔
 30分钟 
 30~60分钟
 30分钟 
 可行并与〈中国药典〉二部一致 
 
3.3试验当日家兔体温之间差异
 38.0℃~39.6℃ 
 未提及 
 38.0℃~39.6℃ 
 虽然在1.3项有要求,但此处在写明更严紧,也与中国药典〉二部一致。 
 
4结果判定
 初、复试结果合格积极不合格合并描述
 初、复试结果合格积极不合格分开描述
 初、复试结果合格积极不合格分开描述 
 无原则差异,保留以往习惯
 
4有效数字
 小数点后一位
 小数点后两位
 小数点后一位
 体温计精度要求±0.1℃,结果要求小数点后两位不合理。修改后与〈中国药典〉二部一致
 
  

细菌内毒素检查法
本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素。以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查有两种方法:凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法,系分别利用细菌内毒素在与鲎试剂形成凝胶过程中具有相关的浊度变化和两者反应过程中产生的凝固酶能使特殊底物显色的原理,从而定量测定细菌内毒素的方法。可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除有专门说明外,以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成,用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。细菌内毒素工作标准品中每1ng细菌内毒素的效价应不小于2EU,不大于50EU。
细菌内毒素检查用水系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。用于细菌内毒素定量测定用的细菌内毒素检查用水,内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
试验准备 试验所用器皿需经处理,除去可能存在的外源性内毒素,常用的方法是250℃干烤至少1小时,也可用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。如果要使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头,要使用标明无内毒素并且对试验不干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。
(注:在本章中,“管”的意思包括其他任何反应容器,如微孔板中的孔。)
供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品,需调节被测溶液(或其稀释液)的pH值,一般要求供试品溶液的pH值在6.0~8.0的范围内。可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适当的缓冲剂来调节pH值。酸或碱溶液要用检查用水在除去内毒素的容器中进行配制。缓冲剂必须经过认证无内毒素和无干扰因子。
内毒素限值的建立 药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定:
L=K/M
式中L为供试品的细菌内毒素限值,以EU/ml,EU/mg或EU/U活性单位表示;
K为按规定的给药途径,人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/(kg·h)表示。注射剂,K=5EU/(kg·h),其中放射性药品注射剂,K=2.5EU/(kg·h),鞘内用注射剂,K=0.2EU/(kg·h);
M为人用每公斤体重每小时最大剂量,以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或U活性单位/(kg·h)表示,人均体重按60kg计算,注射时间不小于1小时,按1小时计算。
确定最大有效稀释倍数(MVD)
最大有效稀释倍数是供试品被允许的最大稀释倍数,在此稀释倍数下可进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD:
MVD=CL/λ
式中 L为供试品的细菌内毒素限值;
C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时,则C等于1.0ml/ml,当L以EU/mg或EU/u表示时,C的单位需为mg/ml或u/ml。
λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml),或是在光度检测中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
方法一:凝胶法 
凝胶法是通过鲎试剂可与内毒素产生凝集反应的原理来检测或定量内毒素。在标准环境中,能够使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度就是鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。为了保证试验的精确性和有效性,要先复核鲎试剂的灵敏度和完成干扰试验。
鲎试剂灵敏度复核 当使用新一批鲎试剂或试验环境中发生了可能会影响检验结果的改变时,须进行鲎试剂灵敏度复核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在旋涡混合器上混匀15分钟,然后制成2.0λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装了0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿,等体积加入内毒素标准溶液。每一个浓度平行做4管,同时在2管中加入0.1ml细菌内毒素检查用水做为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入37±1℃适宜恒温器中,保温60分钟±2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转180°时,管内凝胶不变形,不从管壁滑脱者为阳性,记录为(+);凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性,记录为(-)。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
当最大浓度2.0λ管均为阳性,最低浓度0.25λ管均为阴性,阴性对照管为阴性时,试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值,即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)。
λc=lg-1(ΣX/4)
式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个为阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ~2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时,方可用于细菌内毒素检查,并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验 按表1制备溶液A、B、C和D,使用的供试品溶液应为无可检验出的内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液,操作按鲎试剂灵敏度复核项下。

表1.凝胶法干扰试验溶液的制备 
溶液 
 内毒素浓度/加入内毒素的溶液 
 稀释用液 
 稀释倍数 
 所含内毒素的浓度 
 平行管数 
 

 无/供试品溶液 
 - 
 - 
 - 
 4 
 

 2λ/供试品溶液 
 供试品溶液 
 1 
 2λ 
 4 
 
  
   
   
 2 
 1λ 
 4 
 
  
   
   
 4 
 0.5λ 
 4 
 
  
   
   
 8 
 0.25λ 
 4 
 

 2λ/检查用水 
 检查用水 
 1 
 2λ 
 2 
 
  
   
   
 2 
 1λ 
 2 
 
  
   
   
 4 
 0.5λ 
 2 
 
  
   
   
 8 
 0.25λ 
 2 
 

 无/检查用水 
 - 
 - 
 - 
 2 
 

溶液A:准备进行检查并且未检出内毒素的供试品溶液
溶液B:干扰试验系列
溶液C:鲎试剂标示灵敏度的对照系列
溶液D:检查用水做的阴性对照
只有当溶液A和D的所有平行管都为阴性,并且溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时,试验方为有效。按下式计算溶液C的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品溶液制成的内毒素溶液B的反应终点浓度的几何平均值(Et)。
Es= lg-1(ΣXs/4)
Et= lg-1(ΣXt/4)
式中Xs、Xt分别为C溶液和B溶液的反应终点浓度的对数值(lg)。
当Es在0.5λ~2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时,且当Et在0.5Es和2.0Es(包括0.5Es和2.0Es)时,则认为供试品在该浓度下不干扰试验。如果供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰,将供试品溶液进行不超过MVD的进一步的稀释后,再重复干扰试验。使用更高灵敏度的鲎试剂并对供试品进行更大倍数的稀释有可能排除干扰。
干扰也可通过其他适当的方法排除,如过滤、中和、透析或加热处理等。为确保所选择的处理方法可以有效的排除干扰且不会使内毒素失去活性,要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺有变或当试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。
凝胶法检查法
1)凝胶限量试验 
按表2制备溶液A、B、C、D。

表2凝胶限量试验溶液的制备 
溶液 
 内毒素浓度/添加了内毒素的溶液 
 平行管数 
 

 无/供试品溶液 
 2 
 

 2λ/供试品溶液 
 2 
 

 2λ/检查用水 
 2 
 

 无/检查用水 
 2 
 

溶液A:供试品溶液
溶液B:供试品阳性对照
溶液C:阳性对照
溶液D:检查用水做的阴性对照
使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品液来制备溶液A和B。溶液B和C含有相当于2λ浓度的标准内毒素。溶液D为检查用水。
结果判断 保温60分钟±2分钟后观察结果。只有当供试品阳性对照溶液B和阳性对照溶液C的平行管都为阳性,阴性对照溶液D的平行管为阴性时,试验方为有效。
当溶液A的两个平行管都为阴性时,供试品溶液符合规定。当溶液A的两个平行管都为阳性时,供试品不符合规定。当溶液A的两个平行管中的一个为阳性另一个为阴性时需进行复试。在复试中,溶液A需做4支平行管,当所有平行管都为阴性时,供试品溶液符合规定。
凝胶半定量试验
本方法是通过确定终点浓度来量化供试品溶液中的内毒素。按表3制备溶液A、B、C和D。

表3凝胶半定量试验溶液的制备 
溶液 
 内毒素浓度/加入内毒素的溶液 
 稀释用液 
 稀释倍数 
 所含内毒素的浓度 
 平行管数 
 

 无/供试品溶液 
 检查用水 
 1 
 - 
 2 
 
  
   
   
 2 
 - 
 2 
 
  
   
   
 4 
 - 
 2 
 
  
   
   
 8 
 - 
 2 
 

 2λ/供试品溶液 
   
 1 
 2λ 
 2 
 

 2λ/检查用水 
 检查用水 
 1 
 2λ 
 2 
 
  
   
   
 2 
 1λ 
 2 
 
  
   
   
 4 
 0.5λ 
 2 
 
  
   
   
 8 
 0.25λ 
 2 
 

 无/检查用水 
 - 
 - 
 - 
 2 
 

溶液A:没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。用检查用水进行2倍系列稀释,从通过干扰试验的稀释倍数开始再稀释至1、2、4和8倍,但随后的稀释也不得超过MVD。
溶液B:含2λ浓度标准内毒素的溶液A(供试品阳性对照)。
溶液C:含2λ、λ、0.5λ和0.25λ浓度标准内毒素的检查用水系列。
溶液D:检查用水(阴性对照)
结果判断 试验必须符合以下三个条件方为有效
(1) 阴性对照溶液D的所有平行管为阴性
(2) 供试品阳性对照B的所有平行管为阳性
(3) 溶液C的终点浓度的几何平均值在0.5λ~2λ之间。
用溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ,即算出每个系列的终点浓度,所有平行管的终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度(按“灵敏度的复核”中的公式)。如果试验检验的是供试品的稀释液,则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数。
如果试验中供试品溶液的结果都为阴性,则记录内毒素浓度为小于λ(如果检验的是稀释过的供试品,则记录为小于λ×该供试品的最低稀释倍数)。如果结果都为阳性,记录内毒素的浓度为大于或等于最大的稀释倍数乘以λ(例:在表3中,原始稀释倍数×8×λ)。
当内毒素浓度小于规定的限值时,供试品符合要求。
方法二、光度测定法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。
浊度法是检测浊度增长的光度试验。根据检测原理,可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法的原理是反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在着量化关系。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或是检测浊度增长速度的方法。
显色基质法是检测鲎试剂与内毒素反应时从选定的显色肽中释放出的有色团。根据检测原理,分为终点显色法和动态显色法。终点显色法的基础是反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的数量之间存在的量化关系。动态显色法是检测反应混合物的颜色到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或是检测颜色增长速度的方法。
所有的光度测定试验都要求在特定的仪器中进行,温度一般为37±1℃。
为保证浊度和显色试验的精确性和有效性,要预先进行标准曲线的校验试验以及试验溶液的干扰试验。当试验环境中发生了任何可能会影响检验结果的改变时,试验的有效性就要求重新检验。
校验标准曲线的标准性 用标准内毒素配成溶液并制成至少3个浓度的稀释液(稀释度不得大于10),最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同细菌内毒素检查法凝胶法的要求,每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照在反应时间内不发生反应,将全部数据进行线性回归分析。
根据线性回归分析,标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980,试验方为有效。
光度技术的干扰试验 选择标准曲线中点或一个靠近中间的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等,参照所用仪器和试剂的有关说明进行。每种溶液至少做2个平行管。

表4  光度技术干扰试验溶液的制备 
溶液 
 内毒素浓度 
 加入内毒素的溶液 
 平行管数 
 

 无 
 供试品溶液 
 不少于2个 
 

 标准曲线的中点(或附近点)的浓度(设为λm) 
 供试品溶液 
 不少于2个 
 

 至少3个浓度(最低一点设定为λ) 
 检查用水 
 每一浓度不少于2个 
 

 无 
 检查用水 
 不少于2个 
 

溶液A:稀释倍数未超过MVD的供试品溶液,
溶液B:加入了标准曲线中点或靠近中点的一个内毒素浓度的,和溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液,
溶液C:如“校验标准曲线的标准性”项下描述的,用于制备标准曲线的标准内毒素溶液
溶液D:检查用水(阴性对照)
按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs,再按下式计算该试验条件下的回收率(R)。
从包含添加内毒素的供试品溶液中减去溶液本身的平均的内毒素浓度,可计算出添加内毒素的平均回收率。当内毒素的回收率在50~200%之间,则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。
当内毒素的回收率不在指定的范围内,须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素。并要利用凝胶法干扰试验来验证处理的有效性。
光度法检查法
按照 “光度法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。
使用溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。
试验必须符合以下三个条件方为有效:
1) 系列溶液C的结果要符合“光度技术预试验”下的“校验标准曲线的标准性”中的要求;
2) 用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后,计算出的内毒素的回收率要在50~200%的范围内。
3) 溶液D(阴性对照)在规定的反应时间内没有可检测到的内毒素。
当供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数和浓度后,小于产品的内毒素限值时,供试品符合规定。
细菌内毒素检查法修改说明
在2000年以前,美国、欧洲、日本三个国家的药典收载的细菌内毒素检查法方法各异,所以缺乏可比性,因此2000年由国际协调委员会综合USP、EP、JP的方法求同存异,出台了内毒素检查法的协调案。现在,USP25、EP2000、JP14除保留少许特色外,无论是在方法上还是格式上都已趋向统一。
2000版中国药典细菌内毒素检查法主要是根据24版美国药典制定的,与统一后的细菌内毒素检查法有不小的差异。为使我国的细菌内毒素检查法与世界接轨,本次检查法的修改基本按照USP25、EP2000、JP14的统一格式,对于叙述顺序、风格等进行了较大的调整,但同时也保留了2000年版检查法的特色。
主要是将原来附录指导原则中的细菌内毒素检查法定量方法(光度法)与内毒素检查法合并到一起。由于“凝胶法”和“光度法”的说法是以检测原理命名的, “定量法”是相对于“定性”而叫的,所以认为将“定量法”改为“光度测定法”更为妥当。
凝胶法实验的检查法原来是做2支供试品管、1支供试品阳性对照、1支阳性对照和1支阴性对照(共5支)。由于各种对照是作为实验是否成立的标准,同时参照各国药典的统一格式,故改为做2支供试品管、2支供试品阳性对照、2支阳性对照和2支阴性对照(共8支)。
添加了凝胶法的半定量法。虽然此种方法在我国使用不多,但是许多进口药品的复核标准中都要求使用半定量法,并且各国药典都有收载,所以也作为一种方法提出。
本次修改的格式采用了国际统一的表格方式来表示样品及各种对照的配制。

中检所


崩解时限检查法
本法用于检查微生态活菌胶囊剂、片剂在规定条件下的崩解情况;即在检查时限内全部崩解溶散或成碎粒,除不溶性包衣材料或破碎的胶囊壳外,均应通过筛网。
仪器
采用升降式崩解仪。主要结构为一能升降的金属支架与下端镶有筛网的吊篮,并附有挡板。升降的金属支架上下移动距离为55mm±2mm,往返频率为每分钟30~32次。
吊篮玻璃管6根,管长77.5mm±2.5mm,内径21.5mm,壁厚2mm;透明塑料板2块,直径90mm,厚6mm,板面有6个孔,孔径26mm;不锈钢板1块(放在上面一块塑料板上),直径90mm,厚1mm,板面有6个孔,孔径22mm;不锈钢丝筛网1张(放在下面一块塑料板下),直径90mm,筛孔内径20mm;以及不锈钢轴1根(固定在上面一块塑料板与不锈钢板上),长80mm。将上述玻璃管6根垂直于2块塑料板的孔中,并用3只螺丝将不锈钢板、塑料板和不锈钢丝筛网固定,即得(如图1)。
图 1
(见2000版《中国药典》二部 附录73页 图-1)
挡板为一平整光滑的透明塑料块,相对密度1.18~1.20,直径20.7mm±0.15mm,厚9.5mm±0.15mm;挡板共有5个孔,孔径2mm,中央1个孔,其余4个孔距中心6mm,各孔间距相等;挡板侧边有4个等距离的V形槽,V形槽上端宽9.5mm,深2.55mm,底部开口处的宽与深度均为1.6mm(如图2)。
图 2
(见2000版《中国药典》二部 附录73页 图-2)
检查法
将吊篮通过上端的不锈钢轴悬挂于金属支架上,浸入1000ml烧杯中,并调节吊篮位置使其下降时筛网距烧杯底部25mm,烧杯内盛有温度为37℃±1℃的水,调节水位高度使吊篮上升时筛网在水面下15mm处。
1.片剂
取药片6片,分别置上述吊篮的玻璃管中,启动崩解仪进行检查,各片均应在15分钟内全部崩解。如有1片崩解不完全,应另取6片,按上述方法复试,均应符合规定。
薄膜衣片,按上述装置与方法检查,并可改在盐酸溶液(9→1000)中进行检查,应在30分钟内全部崩解。如有1片不能完全崩解,应另取6片,按上述方法复试,均应符合规定。
肠溶衣片,按上述装置与方法,先在盐酸溶液(9→1000)中检查2小时,每片均不得有裂缝、崩解或软化现象;继将吊篮取出,用少量水洗涤后,每管各加入挡板1块,再按上述方法在磷酸盐缓冲液(pH6.8)中进行检查,1小时内应全部崩解。如有1片不能完全崩解,应另取6片,按上述方法复试,均应符合规定。
2.胶囊剂
硬胶囊剂按上述装置与方法检查,如胶囊漂浮于液面,可加挡板一块。硬胶囊剂应在30分钟内全部崩解, 如有1粒不能完全崩解,应另取6粒,按上述方法复试,均应符合规定。 
肠溶胶囊剂按上述装置与方法,先在盐酸溶液(9→1000)中检查2小时,每粒的囊壳均不得有裂缝或崩解现象;继将吊篮取出,用少量水洗涤后,每管各加入挡板一块,再按上述方法,改在人工肠液中进行检查,1小时内应全部崩解。如有1粒不能完全崩解,应另取6粒,按上述方法复试,均应符合规定。
【附注】 
人工肠液:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.4%氢氧化钠溶液调节pH值至6.8;另取胰酶10g,加水适量使溶解;将两液混合后,加水稀释成1000ml,即得。


融变时限检查法
本法系用于检查栓剂、阴道片等固体制剂在规定条件下的融化、软化或溶散情况。
1.栓剂
仪器
由透明的套筒与金属架组成(如图1)。
图1 图2
(见2000版《中国药典》二部附录74页图-1、图-2)
透明套筒为玻璃或适宜的塑料材料制成,高为60mm,内径为52mm,及适当的壁厚。
金属架由两片不锈钢的金属圆板及3个金属挂钩焊接而成。每个圆板直径为50mm,具39个孔径为4mm的圆孔(如图2);两板相距30mm,通过3个等距的挂钩焊接在一起。
检查法
取供试品3粒,在室温放置1小时后,分别放在3个金属架的下层圆板上,装入各自的套筒内,并用挂钩固定。除另有规定外,将上述装置分别垂直浸入盛有不少于4L的37.0℃±0.5℃水的容器中,其上端位置应在水面下90mm处。容器中装一转动器,每隔10分钟在溶液中翻转该装置一次。
结果判断
除另有规定外,脂肪性基质的栓剂3粒均应在30分钟内全部融化、软化或触压时无硬心;水溶性基质的栓剂3粒均应在60分钟内全部溶解。如有1粒不合格,应另取3粒复试,均应符合规定。
2.阴道片
仪器
同上述栓剂的检查装置,但应将金属架挂钩的钩端向下,倒置于容器内,如图3示意。
图3
(见2000版《中国药典》二部附录74页图-3)
检查法
调节水液面至上层金属圆盘的孔恰为均匀的一层水覆盖。取供试品3片,分别置于上面的金属圆盘上,装置上盖一玻璃板,以保证空气潮湿。
结果判断
除另有规定外,阴道片3片,均应在30分钟内全部融化或崩解成碎粒并通过开孔金属圆盘或仅残留少量无固体硬心的软性团块。如有1片不合格,应另取3片复试,均应符合规定。

最低装量检查法
本法适用于固体、半固体和液体制剂。标示装量不大于500g(ml)者,按下述方法检查,应符合表中规定。为保证临床有效使用,应按“生物制品分装规程”适当增加装量,使制剂装量不少于标示量。
1.抽样量
1.1 注射液:注射液的标示装量为2ml或2ml以下者,取供试品5支,2ml以上至或10 ml者,取供试品3支,10ml以上者,取供试品2支。
1.2 固体、半固体和液体制剂:取供试品5个,标示装量在50 ml(g)以上者,取供试品3个。
2.检查法(适用于标示装量以重量计者)
取供试品,除去外盖和标签,容器外壁用适宜的方法清洁并干燥,分别精密称定重量,除去内容物,容器用适宜的溶剂洗净并干燥,再分别精密称定空容器的重量,求出每个容器内容物的装量;如为固体、半固体和液体制剂还应求出每个容器内容物的平均装量。
3.容量法(适用于标示装量以容量计者)
取供试品,开启时注意避免损失,将内容物分别用干燥并预经标化的注射器(包括注射针头)抽尽,50ml以上者可倾入预经标化的干燥量筒中,黏稠液体倾出后,将容器倒置15分钟,尽量倾净。读出每个容器内容物的装量;如为固体、半固体和液体制剂还应求出每个容器内容物的平均装量。
4.结果判定
每支注射液的装量均不得少于其标示量。
固体、半固体和液体制剂应符合下表规定。 如有1个容器装量不符合规定,另取5个(或3个)复试,应全部符合规定。

  
标示装量 
 固体、半固体和液体 
 黏稠液体(容量法) 
 
平均装量 
 每个容器装量 
 平均装量 
 每个容器装量 
 
20g(ml)以下
 不少于标示装量
 不少于标示装量的93%
 不少于标示装量的90%
 不少于标示装量的85%
 
20g(ml)至50g(ml)
 不少于标示装量
 不少于标示装量的95%
 不少于标示装量的95%
 不少于标示装量的90%
 
50g(ml)至500g(ml)
 不少于标示装量
 不少于标示装量的97%
 不少于标示装量的95%
 不少于标示装量的93%
 

装量(片重)差异检查法
本法用于胶囊剂、片剂、颗粒剂 和散剂的装量检查。
检查法 
1.胶囊剂 :取供试品20粒,分别精密称定重量,并倾出内容物,硬胶囊
用小刷或其他适宜用具拭净,软胶囊用乙醚等易挥发性溶剂洗净,置通风处使溶剂自然挥尽;再分别精密称定囊壳重量,求出每粒内容物的装量与平均装量。
2.片剂:取药片20片, 精密称定总重量;再分别精密称定每片的重量。
3.颗粒剂(单剂量):取供试品10包(瓶),除去包装,分别精密称定每包 (瓶) 内容物的重量, 求出每包(瓶)内容物的装量与平均装量。
4.散剂(单剂量):取散剂10包(瓶),除去包装,分别精密称定每包(瓶) 内容物的重量。
结果判定 
1胶囊剂:每粒的装量与平均装量相比较,超出装量差异限度的胶囊不得多于2粒,并不得有1粒超出限度1倍。

 
 平均装量 
 装量差异限度 
 
 
 0.30g以下 
0.30g或0.30g以上 
 +10% 
+7.5% 
 
  
 

2片剂:每片重量与平均片重相比较,超出重量差异限度的药片不得多于2 片,并不得有1片超出限度1倍。
平均重量 重量差异限度

平均重量 
 重量差异限度 
 
0.    30g以下 
0.30g或0.30g以上 
 +7.5% 
+5% 
 
                                                                                
3颗粒剂(单剂量):每包(瓶)装量应与平均装量相比较 ,超出装量差异限度的颗粒剂不得多于2包(瓶),并不得有1包(瓶)超出装量差异限度1倍。 

平均装量 
 装量差异限度 
 
1.0g或1.0g以下 
1.0g以上至1.50g 
1.50g以上至6.0g 
6.0g以上 
 +10% 
+8% 
+7% 
+5% 
 
  

4散剂(单剂量):每包与标示量相比应符合规定,超出装量差异限度的散剂不得多于2包(瓶),并不得有1包(瓶)超出装量差异限度1倍。


标示装量     
 装量差异限度 
 
0.10g或0.10g以下 
 ±15% 
 
0.10g以上至0.30g  
 ±10% 
 
0.30g以上至1.50g 
 ±7.5% 
 
1.50g以上至6.0g 
 ±5% 
 
6.0g以上 
 ±3% 
 
                                                                  

[注意事项] 
多剂量包装的颗粒剂和散剂,均照最低装量检查法(附录X F)检查,应符合规定。

粒度测定法
本法用于测定微生态活菌颗粒剂、散剂的粒子大小和限度。
测定法:双筛分法
采用大号筛为18号(850μm)和小号筛为200号(75μm)的一迭筛,大号筛上加盖,小号筛下配有密合的接受容器。 
称取10.0g制品,置大号筛内,盖上盖后,保持水平状态过筛,左右往返,边筛动边拍打3分钟。 取不能通过大号筛和能通过小号筛的颗粒及粉末,称定重量,计算其所占比例(%)。
结果判定
应全量通过大号筛,且通过小号筛的应低于全量15%,则判为合格。


F(ab)2含量测定法(SDS—PAGE法)
在电泳过程中,应用一种人工合成的凝胶作为支持物,在电场作用下,使具有不同泳动速度的组分形成各自区带,再通过薄层扫描进行定量检测分析。
仪器
稳压稳流电泳仪
薄层扫描仪
天平
试剂
1. 丙烯酰胺溶液 取丙烯酰胺14g,双丙烯酰胺0.367g,加水使溶解成50ml。
2. 缓冲液 取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)17.8g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)103g、SDS 4g,加水使溶解成2000ml。
3. 10% SDS 溶液 取SDS 10g,加水使溶解成100ml。
4. 样品结合液 取10% SDS 溶液4ml,缓冲液0.2ml,甘油10ml,加水配制成20ml。
5. 电极缓冲液 取上述缓冲液稀释1倍。
6. 固定液 取甲醇400ml,冰醋酸70ml,加水配制成1000ml。
7. 染色液 取考马斯亮蓝2.5g,加500ml甲醇,冰醋酸70ml,再加水使溶解成1000ml。
8. 脱色液 取冰醋酸70ml,甲醇50ml,加水配制成1000ml。
9. 干燥液 取甘油30ml,甲醇200ml,加水配制成1000ml。
供试品溶液的制备
用电极缓冲液将供试品稀释至2mg/ml后,取稀释的供试品0.1ml,加供试品结合液0.1ml ,100℃煮沸1至2分钟或37℃2小时,冷却。
测定法
按下列比例制备需要量凝胶溶液: 0.2mol/L PB: 丙烯酰胺溶液:水:1.5%过硫酸铵体积比为2:1:0.8:0.25。最后加1至2滴四甲基乙二胺(TEMED),混匀后立即将胶液加入电泳槽的玻璃板间,要避免产生气泡。于每一供试品孔内加入已经处理过的供试品25ug蛋白,电泳。电泳条件为每一个供试品孔的电流恒定为2至3mA。当溴酚蓝电泳至底部时停止电泳。
电泳完毕后,将电泳后的胶板放入固定液中过夜。于染色液中染色1至2小时,然后置脱色液中进行脱色,直至底色成为无色为止。用适宜的方法干燥保存胶板。
结果计算
将干燥前或后的胶板用扫描仪于575nm或520 nm处对每一供试品进行扫描,得出(或计算出) 供试品中F(ab)2的百分含量。

类毒素絮状单位(Lf)测定法
根据类毒素与相应抗毒素在适当的含量比例及一定温度条件下经一定反应时间,可在试管中发生抗原抗体结合,产生肉眼可见的絮状凝集反应。利用已知效价单位的絮状反应抗毒素国家标准品(简称:标絮抗)测定待检类毒素的絮状单位(Lf)值。本方法适用于白喉、破伤风类毒素的测定。
仪器 恒温水浴箱;温度计
试剂
硼酸盐缓冲液(pH 7.0~7.2):硼酸钠(Na2B4O7.10H2O)0.5g, 硼酸 (H3BO3) 4.5g, 氯化钠(NaCl) 8.5g, 加蒸馏水1000ml,完全溶解。
标准品溶液的配制
用标准吸管准确量取标准白喉或破伤风絮状反应抗毒素国家标准品,用硼酸盐缓冲液在50ml或100ml容量瓶中准确定容至100Lf/ml。
供试品溶液的配制 
用标准吸管准确量取待检类毒素,加硼酸盐缓冲液稀释。
测定法
用1ml标准吸管准确量取100Lf/ml的标准絮状抗毒素0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml分别加入絮状反应管,用5ml或10ml标准吸管量取供试品分别快速准确加入上述反应管内各1ml,摇匀,放45℃恒温水浴箱,经常观察,记录絮状出现次序和时间(kf)。再取5支反应管,以最先出现絮状之管放中间,前后各加两管不同量标絮抗,每管间隔0.05ml,再向各管中加入供试品1ml,观察絮状出现情况。根据结果再将最先出现管放中间,加入标絮抗,每管间隔0.02ml,同上观察并记录结果,以2~3次相同值为最终测定值。
结果计算
待检类毒素絮状单位(Lf/ml)=稀释标絮抗使用ml数×供试品稀释倍数X100。

A群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖分子大小测定法
本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数(KD)和多糖在规定KD值以前的回收率。
第一法
仪器 
琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL—4B凝胶色谱柱, 组分收集器,紫外分光光度计,色谱泵 
试剂
1. 流动相 称取醋酸铵154g,加水使溶解成1000ml,混匀,用氨水调pH值至7.0,加0.01%叠氮钠防腐 。
2. 蓝色葡聚糖2000溶液 称取20mg蓝色葡聚糖2000,加流动相使溶解成10ml。
3. 铬酸钾或维生素B12溶液 称取10mg铬酸钾或维生素B12,加流动相使溶解成10ml。 
色谱柱的制备 
取琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL—4B凝胶约200ml,加流动相400ml充分搅拌,放置约1小时使其沉淀,倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复3~5次后,加200ml流动相,混匀,置真空抽气装置内抽去凝胶中的空气。于1.5cm ×90cm色谱柱中,将漂洗过的琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL—4B凝胶装至约87cm高,用流动相流洗,流速15~20ml/h,以2~3倍柱床体积的流动相流洗,使柱床平衡。
色谱柱的标定 
取蓝色葡聚糖2000溶液各1ml,加于已平衡的色谱柱中,以流动相流洗,用组分收集器收集洗脱液,每管收集3ml,按照分光光度法(附录IV)项下的比色法于260nm波长测定各管洗脱液的吸光度,以吸光度为纵坐标,洗脱体积(ml)为横坐标分别作图,260nm波长下的峰顶洗脱体积为空流体积Vo。
取铬酸钾或维生素B12溶液1ml,加于已平衡的色谱柱中,以流动相流洗,用组分收集器收集洗脱液,每管收集3ml,按照分光光度法(附录IV)项下的比色法于370nm波长测定各管洗脱液的吸光度,以吸光度为纵坐标,洗脱体积(ml)为横坐标分别作图,370nm波长下的峰顶洗脱体积为柱床体积Vi。 
测定法
取供试品约1ml(含多糖抗原3~5mg,如为冻干制品可用流动相溶解),加于已标定的色谱柱中,用流动相流洗,用组分收集器收集洗脱液,每管收集5ml,按照磷含量测定法(以流动相作空白对照)于820nm测定每管洗脱液的吸光度。以供试品每管洗脱液的吸光度为纵坐标,洗脱液体积(ml)为横坐标作图,主峰峰顶洗脱体积为Ve。 
结果计算
按下述公式计算分配系数。
KD = (Ve – Vo)/(Vi – Vo)
KD为供试品分配系数;
Ve为供试品洗脱液体积,ml;
Vo为空流体积,ml;
Vi为柱床体积,ml。
计算供试品在规定KD值以前的多糖回收率
Rx(%) = Ax/At × 100%
Rx为KD值在制品分子大小检查项下规定的值以前供试品的多糖回收率;
Ax为供试品在规定的KD值以前各管洗脱液的吸光度之和;
At为供试品所有管洗脱液的吸光度之和。
第二法 
仪器 
琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL—4B凝胶色谱柱,紫外监测器,紫外分光光度计、色谱泵 ,组分收集器 
试剂
1. 流动相 称取氯化钠11.7g,加水使溶解使成1000ml,混匀,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0,加0.01%叠氮钠防腐。
2. 蓝色葡聚糖2000溶液 称取20mg蓝色葡聚糖2000,加流动相使溶解成10ml。
3. 铬酸钾或维生素B12溶液 称取10mg,加流动相使溶解成10ml。 
色谱柱的制备
取琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL—4B凝胶约200ml,加流动相400ml充分搅拌,放置约1小时使其沉淀,倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复3~5次后,加200ml流动相,混匀,置真空抽气装置内抽去凝胶中的空气。于1.5cm × 90cm色谱柱中,将漂洗过的琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL—4B凝胶装至约87cm高,用流动相流洗,流速15~20ml/h,以2~3倍柱床体积的流动相流洗,使柱床平衡。
色谱柱的标定 
取蓝色葡聚糖2000溶液1ml和铬酸钾或维生素B12溶液0.2ml,混匀后加于已平衡的色谱柱中,以流动相流洗,流速15~20ml/h,用组分收集器收集洗脱液,并监测各管在206nm 处的吸光度,得到的色谱图中有两个峰,第一峰为蓝色葡聚糖2000洗脱峰,峰顶的洗脱体积为空流体积Vo;第二峰为铬酸钾或维生素B12的洗脱峰,峰顶的洗脱体积为柱床体积Vi。
测定法
取供试品约1ml(含多糖抗原3~5mg,如为冻干制品可用流动相溶解),加于已标定的色谱柱中,用流动相流洗,流速15~20 ml/h,用组分收集器收集洗脱液。于206nm处检测,得到供试品的色谱图。 
结果计算
1. 计算供试品分配系数(KD):
KD = (Ve – Vo)/(Vi – Vo)
KD为供试品分配系数;
Ve为供试品洗脱液体积,ml;
Vo为空流体积,ml;
Vi为柱床体积,ml。
2. 计算供试品在规定KD值以前多糖回收率
Rx(%) = Ax/At ×100%
Rx为KD值在制品分子量大小检查项下规定的值以前供试品的多糖回收率;
Ax为供试品在规定KD值以前的图谱面积;
At为供试品图谱总面积。 
[附注]
1. 过柱操作在10~15 0C下进行。 
2. 样品的加入 进样可采用自动进样阀,也可以直接将样品加在床的表面。

起草说明: 第一法为现行版《中国生物制品规程》方法,第二法为新建方法,拟用第二法代替第一法测多糖分子量大小。

伤寒Vi多糖疫苗多糖分子大小测定法
本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数(KD)和多糖在规定KD值以前的回收率。
仪器装置 
琼脂糖CL—4B凝胶色谱柱,紫外监测器,组分收集器
试剂
1. 流动相 称取氯化钠11.7g,加水使溶解使成1000ml,混匀,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0,加0.01%叠氮钠防腐。
2. 蓝色葡聚糖2000溶液 称取20mg蓝色葡聚糖2000,加流动相使溶解成10ml。
3. 铬酸钾或维生素B12溶液 称取10mg,加流动相使溶解成10ml。 
色谱柱的制备 
取琼脂糖CL—4B凝胶约200ml,加流动相400ml充分搅拌,放置约1小时使其沉淀,倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复3~5次后,加200ml流动相,混匀,置真空抽气装置内抽去凝胶中的空气。于1.5cm X 90cm色谱柱中,将漂洗过的琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL—4B凝胶装至约87cm高,用流动相流洗,流速15~20ml/h,以2~3倍柱床体积的流动相流洗,使柱床平衡。
色谱柱的标定 
取蓝色葡聚糖2000溶液1ml和铬酸钾或维生素B12溶液0.2ml,混匀后加于已平衡的色谱柱中,以流动相流洗,流速15~20ml/h,用组分收集器收集洗脱液,以260nm监测各管的光吸收度,得到的色谱图中有两个峰,第一峰为蓝色葡聚糖2000洗脱峰,峰顶的洗脱体积为空流体积Vo;第二峰为铬酸钾或维生素B12的洗脱峰,峰顶的洗脱体积为柱床体积Vi。
测定法
取供试品约1ml(含多糖抗原3~5mg),加于已标定的色谱柱中,用流动相流洗,流速15~20 ml/h,用组分收集器收集洗脱液,每管约2ml。照O—乙酰基含量测定法,测定每管洗脱液中O—乙酰基的含量,求出O—乙酰基含量最高时的洗脱体积,即为多糖主峰峰顶洗脱体积Ve。
结果计算
计算供试品分配系数:
KD = (Ve – Vo)/(Vi – Vo)
KD为供试品分配系数;
Ve为供试品洗脱液体积,ml;
Vo为空流体积,ml;
Vi为柱床体积,ml。
计算供试品在KD≤0.25时多糖回收率
Rx(%) = I液O—乙酰基的含量/(I液O-乙酰基的含量+ II液O-乙酰基的含量)×100%
Rx为KD值在制品分子量大小检查项下规定的值以前供试品的多糖回收率;
I液: 为合并KD=0.25前的洗脱液;
II液:为合并KD=0.25后的洗脱液。
[附注] 过柱操作在10~15 0C下进行。 

乙醇残留量测定法(康维氏皿扩散法)
乙醇在饱和碳酸钠环境中加热可逸出,在密闭环境中可被重铬酸钾硫酸溶液吸入,反应生成黄棕色物质,可用比色法进行残余乙醇含量限度测定。该法用于血液制品原液检定
试剂 
1. 饱和碳酸钠溶液 取碳酸钠(Na2CO3·10H2O)199.5g,加水200ml,摇匀,即得。用时充分摇匀后取上清液。
2. 重铬酸钾硫酸溶液 取重铬酸钾3.7g,加水150ml,充分溶解后缓慢加入硫酸280ml,放冷,加水至500ml,摇匀,即得。
乙醇对照品溶液的配制 
精密量取无水乙醇30μl,置100ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得0.03%(ml/ml)乙醇对照品溶液。
测定法 
在康维氏皿外圈的凸出部位均匀涂上凡士林,精密量取重铬酸钾硫酸溶液2.0ml加入内圈中,取饱和碳酸钠溶液1.5ml和精密量取供试品1.5ml,加入外圈中,立即加盖玻璃板(粗糙面向下)密封扩散皿,摇匀,80℃反应30分钟后,取内圈溶液,照分光光度法(附录取IA),在650nm波长处测定吸光度。精密量取乙醇对照品溶液1.5ml,同法操作;精密量取1.5ml水,同法操作,做为空白对照。按下式计算:
残留乙醇含量(ml/ml)=(A1/A2)C2
A1 为供试品在650nm处吸光度;
A2 为乙醇对照品溶液在650nm处吸光度;
C2 为乙醇对照品溶液浓度,ml/ml。

蛋白质含量测定(双缩脲法)
蛋白质肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物,其颜色深浅与蛋白质含量成正比,利用标准蛋白质溶液作对照,采用分光光度法测定供试品中蛋白质含量。该法用于血液制品原液检定。
试剂 
双缩脲试剂 取硫酸铜(CuSO4·5H2O)3.0g,酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)9.0g,碘化钾5.0g,氢氧化钠24g,加水使溶解成1000ml,摇匀,即得。
蛋白质对照品溶液的配制 
精密量取适量的蛋白质对照品溶液,加水制成50mg/ml的溶液。
供试品溶液的配制 
精密量取适量的供试品,加水制成50mg/ml的溶液。
测定法
分别精密量取供试品溶液、蛋白质对照品溶液各0.05ml于玻璃试管中,加4.0ml双缩脲试剂,混匀,37℃水浴30分钟,照分光光度法(附录IV A),在540nm的波长处测定吸收度。另精密量取0.05ml水,同法操作,作为空白对照。
结果计算
按下式计算供试品中蛋白质含量。
C= (A1/A2 )×C1×n
C为供试品蛋白质浓度,mg/ml;
A1 为供试品在540nm波长处的吸光度;
A2 为标准品在540nm波长处的吸光度;
C1 为标准蛋白质溶液的浓度,mg/ml。
[附注]
本法的测定范围为1~10mg。



 
     
 

 

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