微生物限度检查法——检查法

   
   (2) 沙门氏菌(Salmonella species)  取营养肉汤培养基3份，每份各100ml,2份分
别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的
稀释剂作空白对照。培养18～24小时，空白对照应无菌生长。取其余2份培养液各1ml，
分别接种于四硫磺酸钠亮绿培养基10ml中，培养18～24小时。分别划线接种于胆盐硫乳
琼脂（或沙门氏、志贺氏菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基
的平板上，培养18～24小时或延至40～48小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供
试品的平板无菌落生长，或有菌落但不同于表2所列特征时，可判为未检出沙门氏菌。
    如供试品平板生长的菌落特征有与表2所列菌落形态特征相符或疑似者，均应挑选2
～3个菌落分别接种于三糖铁琼脂培养斜面上，阳性对照同时接种,培养18～24小时后，
阳性对照的斜面应为红色，底层为黄色，硫化氢阳性，而供试品疑似菌斜面未见红色、
底层未见黄色，可判为未检出沙门氏菌。否则，应继续做革兰氏染色、生化试验、动力
检查与血清凝集试验。
             表2   沙门氏菌菌落形态特征
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 　培 养 基 　│                   菌  落  形  态
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胆盐硫乳琼脂　│无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色。
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沙门氏、志贺　│无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色。
氏菌属琼脂　  │
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曙红亚甲蓝琼脂│无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落。
───────┼────────────────────────────
麦康凯琼脂 　 │无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色。
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    革兰氏染色  照大肠杆菌项下方法操作，镜检。
    靛基质试验  照大肠杆菌项下操作并判断结果。
    尿素酶试验  取疑似菌斜面培养物接种于尿素琼脂培养基斜面上，培养24小时，斜
面变为红色为阳性，不变色为阴性。
    氰化钾试验   取培养20～24小时的疑似菌株营养肉汤培养液，分别用白金耳沾取1
环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，培养24～48小时，对照
管应有菌生长，试验管有菌生长者为阳性，无菌生长为阴性。
    赖氨酸脱羧酶试验  取疑似菌斜面培养物分别接种赖氨酸脱羧酶培养基及对照培养
基上。培养24～48小时，对照管应为黄色，试验管呈紫色为阳性，呈黄色为阴性。
    动力检查  取疑似菌斜面培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基管中，培养24小
时，细菌沿穿刺线外周扩散生长，为动力阳性，否则为阴性。阴性培养物，应在室温保
留2～3天后，再判断。
    血清凝集试验  在洁净载玻片一端，以白金耳沾取沙门氏菌属A～F“0” 多价血清
2～3环，再取斜面上部的培养物少许，与血清混合，将玻片前后侧动,如出现凝集现象,
应以0.9％氯化钠溶液与同株培养物作对照试验,无凝集现象时判为血清凝集阳性。时有
反应迟缓，需将玻片与湿棉球置平皿内，约过20分钟，再观察。仍未出现凝集时，应取
斜面培养物，置含少量0.9％氯化钠溶液的试管中，制成浓菌悬液，在100℃水浴中保温
30分钟，待冷，再作凝集试验。如出现凝集，应判为阳性，否则为阴性。
   上述各项试验反应，一般应为硫化氢阳性（或阴性），靛基质阴性，尿素酶阴性,氰
化钾阴性，赖氨酸脱羧酶阳性，动力检查阳性，A～F“0” 多价血清凝集试验阳性。各
鉴定结果按表3判定。                          
               表3   沙门氏菌检查结果判定
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  序│               血清凝集试验       │        │
    │             (A～F“0” 血清)     │        │
    ├──┬───────┬──────┤生化试验│    结  果
    │凝集│  100℃30分钟 │0.9％氯化钠 │        │
  号│反应│    凝集反应  │溶液对照    │        │
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  1 │阳性│   阳  性     │  阴  性    │  符  合│检出沙门氏菌
  2 │阴性│   阳  性     │  阴  性    │  符  合│检出沙门氏菌
  3 │阴性│   阴  性     │            │  不符合│未检出沙门氏菌
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   上述各项试验任何一项不符合或有可疑反应的培养物,均应进一步鉴定后作出结论。
    (3) 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)  取胆盐乳糖培养基3份，每份各100ml，
2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照,第3份加入与供试液
等量的稀释剂作空白对照。培养18～24小时，空白对照应无菌生长,其余2份培养液划线
接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基平板上，培养18～24小时。当阳性对照的平板呈
现阳性菌落时，供试品的平板无菌落或无疑似菌落生长，可判为未检出绿脓杆菌。
    绿脓杆菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散，表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿
色素扩散。如生长菌落具有上述特征或疑似者，应挑选2～3个菌落，分别接种营养琼脂
培养基斜面上，培养18～24小时，取培养物革兰氏染色，并作氧化酶试验。
    氧化酶试验  取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取营养琼脂培养基斜面培养
物涂于滤纸片上，再滴加新配制的1％二甲基对苯二胺盐酸盐试液,在30秒内呈粉红色逐
渐变为紫红色为氧化酶试验阳性。否则为阴性。
    如证实为非革兰氏阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均可判为未检出绿脓杆菌。
否则，应进行绿脓菌素试验。
    绿脓菌素(Pyocyanin) 试验  取上述琼脂斜面培养物，接种于绿脓菌素测定用培养
基斜面上，培养24小时后，在试管内加氯仿3～5ml,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,
将氯仿移至另一试管中，加入1mol/L盐酸溶液约1ml,振摇后，静置片刻，如在盐酸溶液
层内出现粉红色，即为绿脓菌素阳性。试验同时应有空白对照试验。
    当空白对照试验呈阴性时，供试品检查为革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓
菌素阳性、可判定为检出绿脓杆菌。
    绿脓菌素阴性的培养物，应继续以下试验。
    硝酸盐还原产气试验  取营养琼脂培养基斜面培养物,接种于硝酸盐胨水培养基中,
培养24小时，如在培养基的杜氏管中有气体产生，即为阳性。
    42℃生长试验 营养琼脂培养基斜面培养物于0.9％无菌氯化钠溶液中,制成菌悬液,
再将菌悬液接种于营养琼脂培养基斜面上，立即置41±1℃水浴中培养24～48小时,有菌
苔生长者为阳性；否则为阴性。
    明胶液化试验  以接种针沾取营养琼脂培养基斜面培养物，穿刺于明胶培养基内，
培养24小时，取出置冰箱内10～30分钟。如培养基仍呈溶液状，为阳性。
    当革兰氏阴性杆菌，氧化酶试验阳性，绿脓菌素试验为阴性，其硝酸盐还原产气试
验、42℃生长试验及明胶液化试验均为阳性时，应判为检查绿脓杆菌。
    (4) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)   取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）
培养基3份，每份各100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳
性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作为空白对照。均培养18～24小时(必要时可
延至48小时)。空白对照应无菌生长。取其余2份培养液划线接种于卵黄高盐琼脂培养基
平板上或甘露醇高盐琼脂培养基平板上，培养24～72小时。当阳性对照的平板呈现阳性
菌落时，供试品的平板如无菌落生长，或有菌落但不同于表4所列特征,可判为未检出金
黄色葡萄球菌。
          表4  金黄色葡萄球菌菌落形态特征
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  培养基  │      菌     落    形     态      
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卵黄高盐  │金黄色、圆形凸起，边缘整齐，外围有
琼脂      │卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1～2mm
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甘露醇高盐│金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有
琼脂      │黄色环，菌落直径约0.7～1mm        
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    如有菌落生长并与表4所列特征相符或疑似时,应挑选2～3个菌落，分别接种于营养
琼脂培养基斜面上，培养18～24小时，取其培养物革兰氏染色，并作血浆凝固酶试验。
    血浆凝固酶试验  取灭菌小试管3支，各加入血浆①－无菌水(1:1)0.5ml，1支加入
被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml,其余2支作对照管；1支加入金黄色葡
萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照;另1支加入营养肉汤或0.9％氯化钠
溶0.5ml作空白对照。将3管同时培养。3小时后开始检查,以后适当时间逐次观察直至24
小时。空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；
阳性对照管和空白对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。
    当空白对照和阳性对照符合要求，供试品的菌株为革兰氏阳性球菌、血浆凝固酶试
验阳性，判定为检出金黄色葡萄球菌。
    结果判断
    细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下规
定，应判供试品合格；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不合格。
    细菌菌落数、霉菌(酵母菌)菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时，
应从同一批号样品中随机抽样，复试两次，以三次结果平均值报告。
    眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试报告，须以二次复试结果均不得长菌，方可判
为供试品合格。
    如发现营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵母菌）菌落数或虎红琼脂培养基平板上生
长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时，应判为供试品不合格。
    各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再抽样复试，即应
判该供试品不合格。
    ①  血浆的制备  以无菌注射器吸取灭菌的含5％枸橼酸钠的0.9％氯化钠溶液1ml,
用无菌操作采取家兔（或羊、人）血9ml,轻轻混匀数分钟。待血液不凝固时，徐徐放入
灭菌离心管中，离心，分离血浆，用灭菌吸管取血浆移至灭菌试管中，置冰箱内备用。
临用前必须用已知血浆凝固酶试验阳性的金黄色葡萄球菌测试，证明血浆合格后，方可
用于试验。

 

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