1. 从琼脂平板挑取形态相似的纯培养菌落接种肉汤培养基，并于35度培养至浊度达到或超过0.5麦氏单位，取出用盐水或肉汤调节菌液浓度至0.5麦氏单位，含菌量约（1－2）×108cfu/ml。也可将菌落直接悬浮于无菌盐水或肉汤内，调至0.5麦氏单位，这称为直接菌悬液法。
2. 用无菌棉拭子浸入调好的菌悬液中，将多于菌悬液在管壁挤出，在M-H琼脂平皿上划线，划满整个琼脂表面，旋转平皿60°重复划线共三次，最后一次用拭子涂抹琼脂边缘。置室温3－5分钟。
3.用纸片分配器或无菌镊子取药敏纸片，贴于平板表面，并用镊尖轻压一下纸片，使其贴平。每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm，90mm直径的平板适宜贴6张药敏纸片。
4. 将贴好纸片的平板置35度孵育18－24h后，用游标卡尺量取抑菌圈直径。
根据抑菌圈的大小（不同抗生素其抑菌圈大小的标准不一致），判断为敏感（S），耐药（R）或中介度（I）。
某些细菌可蔓延生长至某种抗生素的抑菌圈内，如磺胺药抑菌圈内可能有微量的细菌生长，可忽略不计，应以外圈为准。
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