β型溶血链球菌检测培养基（GB4789.11-2014）

A.1改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Modified tryptone soybean broth,mTSB）

A.1.1基础培养基（胰蛋白胨大豆肉汤TSB）

A.1.1.1成分

A.1.1.2制法

将A.1.1.1中各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.3±0.2，121 ℃灭菌15 min，备用。

A.1.2 抗生素溶液

A.1.2.1 多黏菌素溶液

称取10 mg多黏菌素B于10 mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀, 充分溶解后过滤除菌。

A.1.2.2 萘啶酮酸钠溶液

称取10 mg萘啶酮酸于10 mL 0.05 mol/L氢氧化钠溶液中，振摇混匀,充分溶解后过滤除菌。

A.1.3 完全培养基

A.1.3.1 成分

A.1.3.2 制法

无菌条件下，将A.1.3.1中各成分进行混合，充分混匀，分装备用。

A.2 哥伦比亚CNA血琼脂(Columbia CNA blood agar)

A.2.1 成分

A.3.1.2 制法

将基础培养基成分溶解于蒸馏水中，加热促其溶解。121 ℃高压灭菌15 min。

A.3.2 无菌脱纤维绵羊血

无菌操作条件下，将绵羊血加入到盛有灭菌玻璃珠的容器中，振摇约10min，静置后除去附有血纤维的玻璃珠即可。

A.3.3完全培养基

A.3.3.1 组分

A.3.3.2 制法

当基础培养基的温度为45℃左右时，无菌加入绵羊血，混匀。校正pH至7.2±0.2。倾注15 mL于无菌平皿中，静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。预先制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4 h，或在4℃冷藏不得超过7 d。

A.4  革兰氏染色液

A.4.1  结晶紫染色液基础培养基

A.4.1.1  成分

A.4.1.2 制法

将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

A.4.2革兰氏碘液

A.4.2.1成分

A.4.2.2 制法

将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

A.4.3.1 成分

A.4.3.2 制法

将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

A.4.4染色操作步骤

将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95％乙醇脱色，约15 s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；滴加复染液，复染1min，水洗后进行干燥，镜检。

A.5胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptone soybean broth, TSB）

A.5.1 成分

A.5.2制法

将A.5.1中各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.3±0.2，121 ℃灭菌15 min，分装备用。

A.6草酸钾血浆

A.6.1 成分

A.6.2 制法

草酸钾0.01 g放入灭菌小试管中，再加入5 mL人血，混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾血浆。

A.7 0.25％氯化钙(CaCl2)溶液

A.7.1 成分

A.7.2 制法

称取22.2g氯化钙（无水）溶于蒸馏水中，分装备用。

A.8 3％过氧化氢(H2O2)溶液

A.8.1 成分

A.8.2 制法

吸取100mL 30％过氧化氢(H2O2)溶液，溶于蒸馏水中，混匀，分装备用。

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