蜡样芽胞杆菌平板计数法（第一法）
4.2操作步骤
4.2.1样品处理
冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2 ℃～5 ℃不超过18 h解冻，若不能及时检验，应放于-10℃~ -20℃保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2 ℃～5 ℃冰箱保存，24 h内检验。
4.2.2样品制备
称取样品25 g，放入盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀，作为1:10的样品匀液。
4.2.3样品的稀释
吸取4.2.2中1:10的样品匀液1 mL加到装有9mL PBS或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成1:100的样品匀液。跟据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
4.2.4样品接种
根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别移入三块MYP琼脂平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
4.2.5分离、培养
4.2.5.1 分离
在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱30 ℃±1℃培养1 h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。如果菌落不典型，可继续培养24 h±2 h再观察。在MYP琼脂平板上，典型菌落为微粉红色(表示不发酵甘露醇)，周围有白色至淡粉红色沉淀环（表示产卵磷脂酶）。
4.2.5.2纯培养
从每个平板（符合4.4.1.1要求的平板）中挑取至少5个典型菌落（小于5个全选），分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，进行确证实验。在营养琼脂平板上，典型菌落为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4 mm～10 mm。
4.3确定鉴定
4.3.1染色镜检
挑取纯培养的单个菌落，革兰氏染色镜检。蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞杆菌，大小为（1μm～1.3μm）×（3μm～5μm），芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状排列。
4.3.2生化鉴定
4.3.2.1 概述
挑取纯培养的单个菌落，进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、V-P试验、葡萄糖利用(厌氧)试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验。蜡样芽胞杆菌生化特征与其他芽胞杆菌的区别见表1。
4.3.2.2动力试验
用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中，30℃培养24h。有动力的蜡样芽胞杆菌应沿穿刺线呈扩散生长，而蕈状芽孢杆菌常呈“绒毛状”生长。也可用悬滴法检查。
4.3.2.3溶血试验
挑取纯培养的单个可疑菌落接种于TSSB琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血现象，而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血，巨大芽胞杆菌为不溶血。
4.3.2.4根状生长试验
挑取单个可疑菌落按间隔2cm～3cm左右距离划平行直线于经室温干燥1d～2d的营养琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h～48h，不能超过72h。用蜡样芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌标准株作为对照进行同步试验。蕈状芽胞杆菌呈根状生长的特征。蜡样芽胞杆菌菌株呈粗糙山谷状生长的特征。
4.3.2.5溶菌酶耐性试验
用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，36 ℃±1 ℃培养24 h。蜡样芽胞杆菌在本培养基（含0.001%溶菌酶）中能生长。如出现阴性反应，应继续培养24 h。巨大芽胞杆菌不生长。
4.3.2.6蛋白质毒素结晶试验
挑取纯培养的单个可疑菌落接种于硫酸锰营养琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，并于室温放置3 d～4 d，挑取培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30 s后倾去，再通过火焰干燥，于载玻片上滴满0.5%碱性复红，放火焰上加热（微见蒸气，勿使染液沸腾)持续1 min～2 min，移去火焰，再更换染色液再次加温染色30 s，倾去染液用洁净自来水彻底清洗、晾干后镜检。观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形蛋白结晶体。如发现游离芽胞形成的不丰富，应再将培养物置室温2 d～3 d后进行检查。除苏云金芽胞杆菌外，其他芽胞杆菌不产生蛋白结晶体。
4.3.3生化分型(选做项目)
根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P试验反应、明胶液化试验，将蜡样芽胞杆菌分成不同生化型别，见表2。
4.4结果计算
4.4.1 典型菌落计数和确认
4.4.1.1选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20 CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果出现a）~f）现象按4.4.2.1中公式（1）计算，如果出现g）现象则按4.4.2.2中公式（2）计算；
a）只有一个稀释度的平板菌落数在20 CFU～200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；
b）2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU～200 CFU之间，但只有一个稀释度的平板有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；
c）所有稀释度的平板菌落数均小于20 CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；
d）某一稀释度的平板菌落数大于200 CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；
e）所有稀释度的平板菌落数均大于200 CFU且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；
f）所有稀释度的平板菌落数均不在20 CFU～200 CFU之间且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU或大于200CFU时，应计数最接近20 CFU或200 CFU的稀释度平板上的典型菌落。
g) 2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU～200 CFU之间且均有典型菌落。
4.4.1.2从毎个平板中至少挑取5个典型菌落（小于5个全选），划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。
式中：
T——样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；
A——某一稀释度蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；
B——鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；
C——用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；
d ——稀释因子。
式中：
T——样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；
A1——第一稀释度（低稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；
A2——第二稀释度（高稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；
B1——第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；
B2——第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；
C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；
C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；
1.1——计算系数（如果第二稀释度蜡样芽胞杆菌鉴定结果为0，计算系数采用1）；
d ——稀释因子（第一稀释度）。
4.5 结果与报告
4.5.1根据MYP平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数，按4.4中公式（1）、公式（2）计算，报告每g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌菌数，以CFU/g（mL）表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
4.5.2 必要时报告蜡样芽胞杆菌生化分型结果。
