肉毒毒素方法介绍

小鼠生物检测：是目前唯一被公认的确认肉毒毒素的方法，是检测肉毒毒素的金标准。

基于免疫化学的检测方法（A、B、E、F型肉素的检测）：

 ELISA法：用来检测肉毒毒素已经有20多年了，但是常规ELISA的检测灵敏度远远低于小鼠生物检测。目前试用的有amp-ELISA、DIG- ELISA，提高了灵敏度，此方法已被用于检测食物样品，检测时间大约需要6h。但是存在型间交叉的问题，阳性样品仍需小鼠生物检测法进行确认。

 PCR法：目前还没有用此方法检测样品，原因是其灵敏度非常高，容易受样品基质的干扰得至假阳性结果。检测纯水中的毒素只需3h。

 目前已发表或试用的其它方法：免疫电泳法、放射免疫法、琼脂凝胶扩散法等。但这些方法的敏感性都不如小鼠生物检测法高

检出试验：

           取上述离心上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠3只，每只0.5mL，观察4d。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h内发病、死亡。主要症状为竖毛，四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以至症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重做试验。

确证试验：

         不论上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小鼠发病、死亡者，取样分成3份进行试验，1份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀，37℃作用30min，1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min；1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可，不做其他处理。3份混合液分别注射小白鼠各2只，每只0.5mL，观察4d，若注射加诊断血清与煮沸加热的2份混合液的小白鼠均获保护存活，而唯有注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有症状死亡，则可判定检样中有肉毒毒素存在，必要时要进行毒力测定及定型试验。

毒力测定：

          取已判定含有肉毒毒素的检样离心上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成50倍、500倍及5000倍的稀释液，分别注射小白鼠各2只，每只0.5mL，观察4d。根据动物死亡情况，计算检样所含肉毒毒素的大体毒力(MLD/mL或MLD/g)。例如：5倍、50倍及500倍稀释致动物全部死亡，而注射5000倍稀释液的动物全部存活，则可大体判定检样上清液所含毒素的毒力为1000～10000MLD/mL。

定型试验：

          按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在10～1000MLD/mL的范围，分别与各单型肉毒抗诊断血清等量混匀，37℃作用30min，各注射小鼠2只，每只0.5mL，观察4d。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素液等量混合作为对照。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。

注：

1.未经胰酶激活处理的检样的毒素检出试验或确证试验若为阳性结果，则胰酶激活处理液可省略毒力测定及定型试验。

2.为争取时间尽快得出结果，毒素检测的各项试验也可同时进行。

3.根据具体条件和可能性，定型试验可酌情先省略C、D、F及G型。

4.进行确证及定型等中和试验时，检样的稀释应参照所用肉毒诊断血清的效价。

5.试验动物的观察可按阳性结果的出现随时结束，以缩短观察时间；唯有出现阴性结果时，应保留充分的观察时间。

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