嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法原理与程序

原理：培养基预先混合嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢，并含有 pH 指示剂（溴甲酚紫）。加入样品并温浴后，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，细菌芽孢将在培养基中生长并利用糖产酸，pH 指示剂的紫色变为黄色。相反，如果样品中含有高于检测限的抗生素，则细菌芽孢不会生长，pH 指示剂的颜色保持不变，仍为紫色。

芽孢悬液：将嗜热脂肪芽孢杆菌菌种划线移种于营养琼脂平板表面，56 ℃培养 24 h 后挑取乳白色半透明圆形特征菌落，在营养琼脂平板上再次划线培养，56 ℃培养24 h 后转入 36 ℃培养 3 d～4 d，镜检芽孢产率达到 95%以上时进行芽孢悬液的制备。每 块平板用 1 mL～3 mL无菌磷酸盐缓冲液洗脱培养基表面的菌苔（如果使用克氏瓶，每瓶使用无菌磷酸盐缓冲液 10 mL～20 mL）。将洗脱液 5 000 r/min离心 15 min。取沉淀物加无菌0.03 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）制成 10 ９ cfu/mL 芽孢悬液，置 80 ℃恒温水浴中 10 min 后，密封防止水分蒸发，置冰箱保存备用。

测试培养基：在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基中加入适量芽孢悬液，混合均匀，使最终的芽孢浓度为 8×10 ５ ～2×10 ６ cfu/mL。混合芽孢悬液的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基分装小试管，每管 200 μL，密封防止水分蒸发。这样配制好的测试培养基可以在冰箱保存 6 个月。

培养操作：吸 取样品100 μL加入含有芽孢的测试培养基中，轻 轻旋转试管混匀。每 份检样作二份，另外再作阴性和阳性对照各一份，阳性对照管为 100 μL 青霉素 G 参照溶液，阴性对照管为 100 μL 无抗生素的脱脂乳。于 65℃水浴培养 2.5 h，观察培养基颜色的变化。如果颜色没有变化，须再于水浴中培养 30 min 作最终观察。

判断方法：在白色背景前从侧面和底部观察小试管内培养基颜色。保持培养基原有的紫色为阳性结果，培养基变成黄色或黄绿色为阴性结果，颜色处于二者之间，为可疑结果。对于可疑结果应继续培养30 min 再进行最终观察。如果培养基颜色仍然处于黄色－紫色之间，表示抗生素浓度接近方法的最低检出限，此时建议重新检测一次。

报告:

最终观察时，培养基依然保持原有的紫色，可以报告为抗生素残留阳性。

培养基变为呈黄色或黄绿色时，可以报告为抗生素残留阴性。

本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为：青霉素3 μg/L，链霉素 50 μg/L，庆大霉素 30 μg/L，卡那霉素 50 μg/L。

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