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细菌回复突变试验仪器和试剂(二)-GB 15193.4—2014


录入时间:2015-1-28 9:59:52 来源:食品安全国家标准

4.2.6  阳性诱变剂的配制
    根据所选择的诱变剂的种类和剂量用适当的溶媒配制阳性对照品(见附录B、附录C)。
    注:培养基成分或试剂除特殊说明外至少应是化学纯,无诱变性。避免重复高温处理,选择适当保存温度和期限。
4.3 10%S9混合液的制备
4.3.1 S9辅助因子的配制
4.3.1.1  镁钾溶液
    氯化镁1.9 g和氯化钾6.15 g加蒸馏水溶解至100 mL。

4.3.1.2 磷酸盐缓冲液(0.2mol/L)(pH7.4)
    磷酸氢二钠(28.4 g/L)    440 mL
    磷酸二氢钠(27.6 g/L)  60 mL
    调pH至7.4,0.103 MPa灭菌20 min或滤菌。
4.3.1.3 辅酶-Ⅱ(氧化型)溶液
    无菌条件下称取辅酶Ⅱ,用无菌蒸馏水溶解配制成溶液(0.025mol/L),现用现配。
4.3.1.4 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液
    无菌条件下称取葡萄糖-6-磷酸钠盐,用无菌蒸馏水溶解配制成溶液(0.05 mol/L),现用现配。
4.3.2  大鼠肝S9组分的诱导和配制
    选健康雄性成年SD或Wistar大鼠,体重150g~200g,周龄约5周~6周。将多氯联苯
(Aroclorl254)溶于玉米油中,浓度为200 g/L。,按500mg/kg体重无菌操作一次腹腔注射,5d后处死
动物,处死前禁食12h。
    也可采用苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备,经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和β萘
黄酮,剂量均为80 mg/kg,连续3d,禁食16 h后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。
    处死动物后取出肝脏,称重后用新鲜冰冷的氯化钾溶液(0.15 mol/L)连续冲洗肝脏数次,以
便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝(湿重)加氯化钾溶液0.1mol/L)3 mL,连同烧杯
移入冰浴中,用无菌剪刀剪碎肝脏,在玻璃匀浆器(低于4000 r/min,1min~2 min)或组织匀浆器(低
于20000 r/min,1min)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。
    将制成的肝匀浆在低温(0℃~4℃)高速离心机上以9000g离心10 min,吸m上清液为S9组分,
分装于无菌冷冻管或安瓿中,每安瓿2 mL左右,用液氮或干冰速冻后置80℃低温保存。
    S9组分制成后,经无菌检查,测定蛋白含量(Lowry法),每毫升蛋白含量不超过40mg为宜,并经
间接致癌物(诱变剂)鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥,保存期不超过1年。
4.3.3  10%S9混合液的制备
    10%S9混合液一般由S9组分和辅助因子按1:9组成,也可将浓度配制成30%(不同受试物所需
S9浓度不同),临用时新鲜无菌配制,或过滤除菌。10%S9混合液10 mL配制如下:
    磷酸盐缓冲液    6.0mL
    镁钾溶液    0.4mL
    葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液    1.0 mL
    辅酶Ⅱ溶液    1.6 mL
    肝S9组分    1.0 mL
    混匀,置冰浴中待用。
    用每平板0.5 mL S9混合液(含20μL~50μL S9)测定其对已知阳性致癌物(诱变剂)的生物活性,
确定最适用量。也可按一般用量,即每平皿0.5 mL S9混合液。

 

 

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