菌株及其鉴定与保存-细菌回复突变试验(GB15193．4-2014)

5．1  试验菌株
    推荐采用下列的菌株组合
    a)  鼠伤寒沙门氏菌TAl535；
    b)  鼠伤寒沙门氏菌TA97a或TA97或TAl537；
    c)  鼠伤寒沙门氏菌TA98；
    d)  鼠伤寒沙门氏菌TAl00；
    e)  鼠伤寒沙门氏菌TAl02或大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrA(PKMl01)。
5．2菌株的鉴定
5．2．1  总则
    菌株特性应与回复突变试验标准相符。菌株的鉴定包括：基因型鉴定、白发回变数鉴定和对阳性致
突变物敏感性的鉴定。
    每3个月进行一次菌株鉴定，遇到下列情况也应进行菌株鉴定：
    a)在收到培养菌株后；
    b)  当制备一套新的冷冻保存或冰冻干燥菌株时；
    c)重新挑选菌株时；
    d)使用主平板传代时。
5．2．2  鉴定方法
5．2．2．1  增菌培养
    在5 mL营养肉汤培养基中用接种环接种贮存菌培养物，37℃振荡(100次／min)培养10 h或静置
培养16 h，使活菌数不少于1×109／mL～2×109／mL。

5．2．2．2组氨酸缺陷型(his)的鉴定
5．2．2．2．1  底层培养皿的制备
    加热融化底层培养基两瓶。一瓶不加组氨酸，每100 mL底层培养基中加0.5mmol D-生物素
0.6 mL；另一瓶加组氨酸，每100 mL底层培养基中加L-组氨酸l mL和O．5 mmol D-生物素0.6mL。
冷却至50℃左右，每种底层培养基各倒两个平板。
5．2．2．2．2  接种
    取有组氨酸和无组氨酸培养基平板各一个，按菌株号顺序各取一接种环的菌液划直线于培养基表
面，37℃培养48 h。
5．2．2．2．3  结果判定
    株菌在有组氨酸培养基平板表面各长出一条菌膜，在无组氨酸培养基平板上除白发回变菌落外无
菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。

5．2．2．3脂多糖屏障缺陷(rfa)的鉴定
5．2．2．3．1  接种
    加热融化营养肉汤琼脂培养基。取菌液0.1mL移人平板，迅速将营养肉汤琼脂培养基(冷却至
50℃左右)适量倒入平板，混匀，平放凝固。将无菌滤纸片一片放入已凝固的培养基平板中央，用移液
器在滤纸片上滴加0.1％结晶紫溶液10μL，37℃培养24 h，每个菌株做一个平板。
5．2．2．3．2  结果判定
    阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带，说明存在rfa突变。这种变化允许某些大分子物质进
入细菌体内并抑制其生长。

5．2．2．4 R因子(抗氨苄青霉素)的鉴定
5．2．2．4．1  接种
    加热融化营养肉汤琼脂培养基，冷却到50℃左右，适量倒入平板中，平放凝固，用移液器吸o．8％的
氨苄青霉素10肛L，在凝固的培养基表面沿中线涂成一条带，待氨苄青霉素溶液干后，用接种环取各菌
株菌液与氨苄青霉素带相交叉划线接种，并且接种一个不具有R因子的菌株作氨苄青霉素抗性的对
照，37℃培养24 h，一个平板可同时鉴定几个菌株。
5．2．2．4．2  结果判定
    菌株在氨苄青霉素带的周围依然生长不受抑制，即有抗氨苄青霉素效应，证明它们都带有R因子。

5．2．2．5  四环素抗性的鉴定
5．2．2．5．1  接种
    用移液器各吸取5弘L～10肛L o．8％的四环素溶液和o．8％的氨苄青霉素溶液，在营养肉汤琼脂培
养基平板表面沿中线涂成一条带，待四环素和氨苄青霉素溶液干后，用接种环取各菌株菌液与四环素和
氨苄青霉素带相交叉划线接种TAl02和一种有R因子的菌株(作四环素抗性的对照)，37℃培养24 h。
5．2．2．5．2  结果判定
    TAl02菌株生长不受抑制，对照菌株有一段生长抑制区，表明TAl02菌株有抗四环素效应。

5．2．2．6 uvrB修复缺陷型的鉴定
5．2．2．6．1  接种
    在营养肉汤琼脂培养基平板表面用接种环划线接种需要的菌株。接种后的平板一半用墨纸覆盖，
在距15 W紫外线灭菌灯33 cm处照射8 s，37℃培养24 h。
5．2．2．6．2  结果判定
    对紫外线敏感的三个菌株(TA97、TA98、TAl00)仅在没有照射过的一半生长，具有野生型切除修
复酶的菌株TAl02仍能生长。

5．2．2．7  生物素缺陷型(bio)的鉴定
5．2．2．7．1  底层培养皿的制备
    加热融化底层培养基两瓶。一瓶加生物素，每100 mL底层培养基中加0．5 mm01 D生物素O．6 mL
和L组氨酸1 mL；另一瓶不加生物素，每100 mL底层培养基中加L组氨酸1 mL，冷却至50℃左右，
每种底层培养基各倒两个平板。
5．2．2．7．2  接种
    取有生物素和无生物素培养基平板各一个，按菌株号顺序各取一接种环的菌液划直线于培养基表
面，37℃培养48 h。
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5．2．2．7．3  结果判定
    株菌在有生物素培养基平板表面各长m一条菌膜，在无生物素培养基平板上除白发回变菌落外无
菌膜，说明受试菌株确为生物素缺陷型。
5．2．2．8  自发回变率的测定
5．2．2．8．1  测定方法
    准备底层培养基平板8个。融化顶层培养基8管，每管2 mL，在45℃水浴中保温。在每管顶层培
养基中，分别加入待鉴定的测试菌株的菌液o．1 mL，一式两份，轻轻摇匀，迅速将此试管内容物倒人已
固化的底层培养基平板中，转动平板，使顶层培养基均匀分布，平放固化，37℃培养48 h，计数菌落数。
5．2．2．8．2  结果判定
    每一株的自发回变率应落在表A．3所列的正常范围内。
5．3菌株的保存
    鉴定合格的菌株应保存在深低温(如一80℃)，或加人9％光谱级DMSO作为冷冻保护剂保存在液
氮条件下(  196℃)。无上述条件者可冰冻干燥制成干粉，4℃保存。除液氮条件外，保存期一般不超
过2年。主平板贮存于4℃，超过2个月后应丢弃(TAl02除外，保存2周后丢弃)。

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