显微镜油浸系物镜的使用

                  显微镜油浸系物镜的使用
 
一、实验目的和内容
目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
内容：1．学习油浸系物镜的使用方法。
      2．用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。
二、实验材料和用具
枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色装片。
香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。
三、操作步骤
(一)观察前的准备
1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。坐正，练习用左眼观察。
2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。
(二)低倍镜观察染色装片
首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。
(三)高倍镜观察
眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。
(四)油镜观察
1．提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。
2．从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。
3．将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。
4．再次观察 提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。
(五)镜检完毕后的工作
1．移开物镜镜头。
2．取出装片。
3．清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。
4．擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。
四、注意事项
1．使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察
2．下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。
3．使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。
4．注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。
五、实验报告
分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率。
六、问题和思考
1．用油镜便于观察细菌的依据是什么？
2．使用油镜应特别注意哪些问题？
3．当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？
油镜的基本原理
（一）油镜头的辨认
油镜头上常刻有OI(oil immersion)或HI（homogeneneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，在低倍物镜、高倍物镜和油镜3物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短（图5—1）
 （二）显微镜的分辨率
显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它分辩率的大小。分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比。
从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。
数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积； 
影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。
当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n= 1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角（图5—2A）。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射（图5—2B），不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55μm。当使用数值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42μm；而使用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的距离则为0.22μm。
   

 

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