目的：初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。
内容：1．制作细菌染色装片。
2．进行革兰氏染色法操作。
二、实验材料和用具
苏云金杆菌或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)菌液，待测菌菌液1～2种。
革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。
三、操作步骤
(一)制片
1．涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。
2．干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。
3．固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。
(二)染色
l．初染 于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。
2．媒染 滴加卢戈氏碘液，lmin后水洗。
3．脱色 滴加95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止 (根据涂片之厚薄需时30s至lmin)，水洗。
4．复染 滴加石炭酸复红液复染lmin，水洗。
5．滤纸吸干，油镜镜检。
(三)结果
革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。
(四)检测未知菌
用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。
四、注意事项
1. 涂片务求均匀，切忌过厚。
2．在染色过程中，不可使染液干涸。
3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌。
4．老龄菌因体内核酸减少，会便阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。
五、实验报吉
(一)绘图
1．大肠杆菌革兰氏染色视野图。
2．金黄色葡萄球菌或苏云金杆菌革兰氏染色视野图。
(二)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。
(三)未知菌的检测结果。
六、问题和思考
1．涂片后为什么要进行固定?固定时应注意什么?
2．什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么?
3．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。
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