病毒细胞培养法及病变观察

  细胞培养法是目前培养病毒应用最广的一种培养方法，其优点是（1）经济适用，结果正确且敏感；（2）较实验动物易于控制。细胞培养法多应用于病毒的分离培养，进行血清中和试验及制造疫苗和抗原等方面。很多组织细胞，包括鸡胚、鼠胚、各种动物的肾组织细胞，人胚羊膜组织细胞或流产胎儿组织细胞（应在死后6 小时内采取，因时间过长，组织细胞生长成功率下降）等均可作细胞培养的来源。

  细胞的选择主要依据组织细胞对病毒的敏感性。能引起病变的组织细胞，往往取自病毒的自然宿主，特别是引起疾病的宿主的某些脏器组织细胞。人类病毒，用人或猴的组织细胞较敏感，但这不是绝对的，如地鼠肾细胞较人肾细胞对流行性乙型脑炎病毒敏感。

（一） 原代细胞培养法

【材料】

9～10 日龄鸡胚、Hanks 氏溶液、0.25％胰酶溶液、无菌小剪、镊子、无菌培养皿、毛细吸管、吸管、沉淀管、无菌细胞培养管（抗生素空瓶）、100 毫升无菌玻璃瓶或三角烧瓶、备有四层纱布的玻璃漏斗。

【方法】

1．用碘酒消毒鸡胚蛋气室外壳，并将它直立于蛋架上，以镊子将鸡胚取出放入无菌培养皿内，去头爪及内脏。

2．用小剪在培养皿内将胚胎剪成小块（4～5 毫米3），加Hanks 氏溶液（约10毫升）冲洗，静置1～2 分钟后，用毛细吸管吸取液体。依同法再洗涤2 次，将血球充分洗去。

3．用镊子将组织块放入无菌玻璃瓶或三角烧瓶内，加入10～15 毫升0.25％胰酶溶液，37℃水浴20 分钟，中间摇动几次。由于胰酶的作用可使大量细胞游离，液体变混。经四层纱布过滤后的细胞悬液，低速离心沉淀（1000 转/分以内）5 分钟，吸取上清液，沉淀物加入适量营养液，用白细胞计数的方法进行计数，使成每毫升含50～80 万细胞悬液以作单层细胞培养。

4．每一细胞培养管，注入细胞悬液1 毫升，盖好瓶塞，并将瓶略加摇动，横卧于有槽木架上，使细胞均匀平铺于管壁。置37℃温箱孵育，一般4 小时，细胞附着于管壁，48 小时可长成单层，此时即可调换营养液，接种病毒。

（二） 传代细胞培养法

从人及动物组织，特别是肿瘤组织，经过多次传代可建立传代细胞系。这种细胞能无限地传代，但并不是所有的组织细胞都能建立传代细胞。有一些传代细胞对病毒敏感范围较广，曾被利用作病毒的分离和鉴定。如HeLa 细胞，Hep－2 细胞及KB 细胞。HeLa 细胞对脊髓灰质炎三型病毒，腺病毒及大多数实验室适应的ECHO 病毒都敏感。Hep－2 细胞也曾用来分离脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A 组病毒、腺病毒、RS 病毒。HeLa 细胞来自子宫颈癌，Hep－2 细胞来自喉癌，而KB 细胞来自上腭癌。由于传代细胞有致肿瘤作用，目前仅用做病毒的分离鉴定及一些病毒学的研究而不能用于疫苗的生产。

【材料】

单层细胞培养瓶，营养液，0.25％胰蛋白酶溶液，无菌吸管，无菌细胞瓶。

【方法】

1．将成片细胞的生长液倒掉，用Hanks 液洗一次。

2．加入适量的0.25％胰蛋白酶，37℃孵育1 分钟。

3．将细胞瓶倒放，细胞在上，胰酶在下，继续孵育37℃5～10 分钟。

4．将胰蛋白酶倒掉，再加入原量的生长液，用10 毫升吸管吹打分散细胞。

5．用生长液按原量3～4 倍稀释，即一瓶细胞能传3～4 瓶。

（三） 细胞培养接种病毒的方法及病变观察

【材料】

单层细胞培养管、营养液、Hanks 溶液、无菌毛细滴管和腺病毒稀释液。

【方法】

1．取已长成单层细胞的培养瓶二只，用无菌毛细滴管吸去管中液体，用Hanks溶液洗二次。

2．用无菌的1 毫升吸管吸稀释的腺病毒液0.1 毫升加入一只单层细胞培养瓶中，另一只加0.1 毫升营养液不接种病毒作为对照，细胞瓶放平，使其接触整个细胞层，置37℃作用1 小时，使病毒吸附到细胞上。

3．取出单层细胞瓶，每只中加入营养液0.9 毫升，盖紧后置37℃孵箱中培养1～2 天。

4．取出细胞在低倍显微镜下观察，注意种毒与对照二管的细胞形态，排列等。

注：为方便保存，此处观察的细胞已经过固定和染色。

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