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溶源性细菌的检查与鉴定


录入时间:2015-3-9 10:37:35 来源:青岛海博生物

      原理

细菌染色体上整合有前噬菌体(或称原噬菌体)并能正常生繁殖而不被裂解的细
,称为溶源细菌。溶源性细菌在然界中普遍存在,而且自发裂解,释放温和噬菌
体,
但频率较低(10-2~105)物理方法(如紫外线和高温)和化学方法(如丝裂霉素C)可诱导大部分溶源裂解并释放温和噬菌体。溶源性细菌对同种或关系密的噬菌
有免疫性,因此对溶源菌的检查必须相应的敏感菌株才能确定,敏感菌株对以从待检的溶源菌相近的种或变种或不菌株中找到。

溶源性细菌裂解释放噬体,会给发酵工业带来威胁,溶源性细使宿主细胞发生溶源转变,不仅可以保护溶源免受同噬菌体的感染,还会赋予宿主细胞新的特性温和噬菌体被广泛用转导、基因工程载体和分生物学等领域。实验采用诱导方法使溶源细裂解.再用敏感菌双层平板法检测诱导后噬菌体释放数目的增加,从而确认细的溶源性。

材料

1. 待检菌——大肠杆225 (λ),敏感菌——大肠杆菌226
2
.基及药品和试剂 LB固体、半体和液体培养基,1%蛋白胨,100mmol/l Tris-HCL(pH7.6)缓冲液或生理盐水,仿,0.2%柠檬酸钠溶液。
3设备 水浴、台式离心机、紫外光灯、摇床等。
4器皿及其他 试管、培养皿、角瓶、吸管,离心管、滤膜、滤膜滤器等。

方法与步骤

实验采用紫外线处理诱导溶源菌裂解,未经诱导处理的溶源菌菌悬液做对照。
1.溶源菌培养 将经LB斜面活化的大肠菌225λ),接种装有20mlLB培养液的250ml角瓶内,30振荡培养16h从中取2ml菌悬液接另装有20ml LB培养液的250ml角瓶内,37振荡培养2h至对数期。

2排除游离噬菌体 如待检菌株为芽孢杆菌,可先制成孢悬液,经80℃ 10min处理,杀死溶源菌表面可能吸附的及游        离的噬菌体;如待检菌抹为非芽孢杆菌,利用噬菌体制备的抗血清或0.2%柠檬酸钠溶液洗涤对数期溶源菌细胞,除去表面吸附的及游离的噬菌体。然后经4000r/min离心10min清液加人敏感指示菌做双层平板测定用于检验样品屮足孖钌游离的噬菌体及吸附「溶源菌表曲的噬体,离心的菌体细胞进行诱导处理。

3.诱导溶源 离心后收体用无菌生理盐水洗涤两次,用生盐水或100mmol/l Tris-HCL缓冲液(pH7.0制成终浓度为1011个/ml细胞的菌悬液,每加5ml菌悬液,经紫外灯30W距离30cm、照射30s即加入5ml双倍浓度的LB液,混匀后37黑暗2h

4,溶源性株检查 按双琼脂法操作,取上述诱导裂解液加入仿,以10倍稀释法适当稀释,选择后3个稀释度的稀释液,毎个稀释液取0.3ml与0.2ml对数期敏感大肠杆菌226悬液混匀,再融化后冷却至45℃的LB半体培养基,立即混匀,随即倾入LB固体培养平板上凝固后,37培养6h观察。经过培的平板如量噬菌斑出现就证明被检菌株是溶源菌。

 

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