一、实验目的和内容
目的：了解自然存在的酵母菌及其形态结构。了解酵母菌产生子囊孢子的条件及其形态。
内容：
1．观察酵母菌个体形态。
2．观察酵母菌的假菌丝和繁殖过程。
3．观察自然状态的酵母菌。
二、实验材料和用具
酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)斜面菌种。
PDA培养基、麦氏(McCLary)培养基(醋酸钠培养基)、0.05%美蓝染色液(以pH6.0的0.02mol/L磷酸缓冲液配制)、碘液、0.04%的中性红染色液%孔雀绿，0.5%沙黄液、95%乙醇；
显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、V形玻璃棒、放置一个三角形玻璃棒支架的培养皿。
三、操作步骤
(一)酵母菌形态观察
1．酵母菌的话体染色观察及死亡率的测定
(1)以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。
(2)取0.05%美蓝染色液1滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2～3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。
(3)在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5～6个视野。
酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算：
死亡率=死细胞总数÷死活细胞总数×100%
2．酵母菌液泡系的话体观察 于洁净载玻片中央加一滴中性红染色液，取少许上述酵母菌悬液与之混合，染色5min，加盖玻片在显微镜下观察。细胞无色，液泡呈红色。
3．酵母菌细胞中肝糖粒的观察 将1滴碘液置于载玻片中央，接人上述酵母菌悬液，混匀，盖上盖玻片，显微镜观察，细胞内的贮藏物质肝糖颗粒呈深红色。
4．酵母菌子囊孢子的观察
(1)活化酿酒酵母：将酿酒酵母接种至新鲜的麦芽汁培养基上，置28C培养2～3d，然后再移植2～3次。
(2)转接产孢培养基：将活化的酿酒酵母转接至醋酸钠培养基上，置30℃恒温培养14d。
(3)观察：挑取少许产孢菌苔于载玻片的水滴上，经涂片、热固定后，加数滴孔雀绿，lmin后水洗，加95%乙醇30S，水洗，最后用0.5%沙黄液复染30S，水洗去染色液，最后用吸水纸吸干。制片干燥后，镜检，子囊孢子呈绿色，子囊为粉红色。注意观察子囊孢子的数目、形状和子囊的形成率。
(4)计算子囊形成的百分率：计数时随机取3个视野，分别计数产子囊孢子的子囊数和不产孢子的细胞，然后按下列公式计算：
子囊形成率（%）=3个视野中形成子囊的总数
÷3个视野中（形成子囊的总数+不产孢子细胞总数）×100%
5．酵母菌假菌丝的观察 取一无菌载玻片浸于溶化的PDA培养基中，取出放在温室培养的支架上，待培养基凝固后，进行酵母菌划线接种，然后将无菌盖玻片盖在接菌线上(图12—1)，28℃培养2～3d后，取出载玻片，擦去载玻片下面的培养基，在显微镜下直接观察。可见到芽殖酵母形成的藕节状假菌丝，裂殖酵母则形成竹节状假菌丝(图12—2)。
6．自然状态下的酵母菌观察 取一滴美蓝染色液于载玻片中央，春夏秋季取酱油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜汤上的白膜，将其置于载玻片染色液中，盖上盖玻片，显微镜下仔细观察酵母菌形态，出芽生殖，假菌丝等。
四、注意事项
1．用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润。
2．在产孢培养基上加大移种量，可提高子囊形成率。
3．通过微加热增加酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。
五、实验报告
(一)绘图
1．数个酵母菌细胞，示观察到的结构。
2．数个子囊及子囊孢子形态图。
(二)记录并计数酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始记录及计算结果)。
六、问题和思考
1．酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别?
2．如何区别营养细胞和释放出的子囊孢子?
3．试设计一个从子囊中分离子囊孢子的试验方案。
注：
酵母菌的简易培养 配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，装入三角瓶中(液面高度2～2cm )，加HCl调至pH3～5放入几块葡萄皮（或其他糖分较高的果皮），置5～28℃温箱中培养2～3d，闻到酒香味后，即可取培养液镜检
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