滤膜法

滤膜由一个多孔的醋酸纤维、硝酸纤维或混合纤维酯的圆形薄膜构成。滤膜的孔径范围从10nm到8μm或更大，对大多数微生物分离和计数时使用的滤膜孔径为0.43 ~
0.47μm。少数直径很小的细菌需要直径为0.2〜0.22μm的滤膜。

含有方格的膜有助于菌落的计数。为了处理多个样品和稀释液，很多生产厂商生产了使用滤膜的仪器，包括复式接头滤器。

釆用适当的正压或负压，可以使大量的水或水溶液快速通过，但是膜的微小的孔径可以阻止细菌的通过。残留在滤膜表面上的细苗可通过将膜放在吸收垫上进行培养，该吸收垫饱和地吸收了液体培养基。膜上的毛细孔可以吸收营养液并能将营养提供给细菌。培养后一个细菌长成一个菌落。所用的培养基是滤膜法专用的培养基，含有与标准培养基不相同的成分。这种培养基可以在实验室自制也可从公司生物公司直接购买脱水制品或配制好的培养基。另外，也可以将滤膜放在配制好的琼脂培养基表面上进行培养。在使用选择性琼脂培养基时，由于培养基的组分不同其扩散率也不同，这会严重影响培养基的选择性,所以要测定选择性琼脂培养基的适用性。

若样品可以轻易通过滤膜,那么滤膜菌落计数具有可以从大量样品中检测出少量微生物的优点。只要滤膜计数具有菌落计数方法的准确度，那么就可以达到多管计数的灵敏度。

另外，当细菌被染色后,将滤膜经浸渍油或棉籽油等处理后会变为透明状，这时就可
进行显微镜镜检。亚甲基蓝和结晶紫适用于这种染色。

滤膜可以用于对水、气体、糖溶液和一些饮料进行常规检验。如果将乳和乳制品中的脂肪血细胞预先用等辛基苯氧基聚乙氧基乙醇等合适的润湿剂分解，也可以用滤膜进行菌落检测。

滤膜还有一些其他的用途,如对液体(包括微牛物培养基〉和气体等进行灭菌。在临床上还能用于无菌液体的无菌测试和从细菡中分离噬菌体。

用滤膜法进行菌落计数的常规操作步骤：

(1)仪器的灭菌 将滤膜放在滤纸之间，用纸包好，在121℃下高压灭菌15min.每天实验前，将滤器上的螺丝拧松并用纸包好，121℃下高压灭菌15min。每次过滤不同样品前，用酒精擦洗漏斗顶部并用火焰灼烧。

将带有吸收垫的培养罐或培养皿包好后，高压灭菌或干热灭菌。

（2）培养皿的制备 在每个培养皿中的无菌吸收垫上无菌操作加入足量的灭菌培养基，使吸收垫达到饱和，即刚好看不到多余的培养基。

（3）样品的过滤和膜的培养 将滤器、抽吸泵以及过滤瓶连接。取下滤器上部的漏斗，用无菌的镊子小心取一片灭菌的滤膜，有格的一面朝上，放在滤器的平面上(操作时要小心，不要污染漏斗内部)然后将漏斗复位，并将其固定好。

将液体祥品倒入漏斗，用抽吸泵进行过滤。过滤完样品后，用25%无菌Ringer氏溶液洁洗漏斗减小泵的吸力，无菌操作取下上部漏斗，用无菌的镊子将滤膜夹到含有吸收垫的培养皿中，吸收垫预先在合适的培养基浸透过。将滤膜放在吸收垫上，轻微旋转，以避免在膜和垫之间产生气泡。盖上平皿盖，盖朝上放入培养箱培养，培养的时间一般小于平板计数的培养时间。

培养后记下菌落数并计算每毫升或每克样品的菌落数。有时菌落的颜色和膜的颜色无明质反差，这时需要对膜或菌落染色，以便准确计数。染色程序如下：

(1)孔雀石绿膜染色法培养后，将膜在0.01%的孔雀石绿水溶液中浸泡3〜10s，过量的染色液倒入装有消毒液的缸中。这种方法只对膜染色，而对菌落不染色。

(2)亚甲基蓝齒落染色法用0.01%亚甲基蓝水溶液使吸收垫达到饱和。然后将带菌的滤膜在吸收垫上放置5min,将膜移到浸透过水的吸收垫上。亚甲基蓝从膜上的脱色速度快于从菌落上的脱色速度，菌落与膜有明显的色差时就可以进行菌落计数。

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