丝状真菌形态特征观察

目的

学习并掌握观察毛霉和根霉形态特征的基本方法。

原理

毛霉和根霉都属于真菌的接合菌门。它们是空气中最常见的污染菌。菌落生长迅速，表面呈棉花样，初为白色，以后变灰至褐灰色。菌丝单细胞无横隔，有分枝，多核。毛霉无假根；根霉有假根和匍匐丝。无性生殖产生孢囊孢子。孢囊梗直接由菌丝体上长出，孢囊梗顶端膨大形成孢囊，孢囊成熟破裂后，露出囊轴，囊轴基部与孢囊梗连接处称为囊托。毛霉无囊托，根霉的假根上方产生孢囊梗。孢囊孢子呈球形、卵形或不规则形。有性生殖形成接合孢子，常为异宗配合即由“+”“－”型菌丝接合形成。这些结构均可通过制水压片在低倍镜下进行观察。

很多青霉、曲霉及镰刀菌尚未发现它们的有性生殖阶段，常称为半知菌。 即只知其生活周期的一半。目前已发现有些菌的有性阶段属于子囊菌或担子菌。这三种菌的无性生殖阶段均有特征性的分生孢子梗及分生孢子形态和分生孢子着生方式。它们多是腐生菌，广泛分布于土壤、空气、水果和粮食中。青霉菌落多为灰绿色，菌落质地绒状、絮状、绳状或束状，成熟后表面呈粉末状。青霉菌丝可直接分化形成分生孢子梗，其顶端具有对称或不对称的扫帚状分枝，其上着生几轮小梗，小梗顶端着生成串的球状或卵状的绿色分生孢子。曲霉菌落呈绒毛状或絮状，表面有同心圆形的轮状带。分生孢子梗长在厚壁的足细胞上，不分枝，顶端膨大成球形、椭圆形或棍棒状顶囊。其表面着生一层或两层小梗，下层为柱状初生小梗，上层为瓶状次生小梗，顶端着生成串的球状分生孢子。镰刀菌菌落呈绒毛状，多为白色、粉红色或紫红色。菌丝分隔有分枝。具有两种分生孢子，小型分生孢子梗分枝或不分枝，其顶端有链状或假头状着生的小型分生孢子。大型分生孢子梗不分枝，其顶端着生镰刀状大型分生孢子，多隔，单生或丛生。

载片培养法是研究丝状真菌生长繁殖全过的有效方法。即将菌丝体接种在载玻片上的小块培养基薄片上，加盖盖玻片，使丝状真菌只能在载玻片和盖玻片的狭窄空间内横向生长，因而可观察到孢子萌发、菌丝生长及孢子形成的各生长阶段，且不会因观察而污染标本片。

材料

1．菌种：毛霉（Mucor）“+”、“－”型菌株

根霉（Rhizopus）

青霉（Penicillium sp.）

曲霉（Aspergillus sp.）

镰刀菌（Fusarium sp.）

2．浮载剂：乳酸酚溶液。

3．培养基：真菌培养基。

4．其它：无菌培养皿，载玻片，盖玻片，无菌水，擦镜纸，吸水纸及接种钩。

方法

1．形态观察

（1）直接观察：不打开培养皿盖，将培养皿置于载物台上，在低倍镜下直接观察毛霉和根霉的各部分结构。

（2）制水压片：取一洁净载玻片，于中央滴1 滴乳酸酚溶液，用接种针挑取少许菌丝及孢囊于染液中，用两根接种针将其拉松散，再轻轻盖上盖玻片。注意：千万不要有气泡！置于高倍镜下进行观察。

2．毛霉接合孢子观察

（1）培养：分别在已倒好马铃薯葡萄糖培养基的平皿背面中央划一条线，于线左右分别标“－”“+”， 然后取相应的毛霉菌株接种，并在26℃ 恒温箱中倒置培养7 天。

（2）镜检：在低倍镜下沿划线处寻找接合孢子，在显微镜下直接观察，或制成水压片进行观察。

3．载片培养法观察菌体形态结构

（1）准备材料：在培养皿内放1 张圆形滤纸片，1 个U 型架，1 片载玻片和2 片盖玻片，灭菌后备用；

（2）制薄层培养基：取一平底无菌培养皿，向内倒入约5ml 已融化马铃薯葡萄糖培养基，迅速摇匀使成薄层。凝固后，用无菌解剖刀割为1cm2 小块；

（3）制片：在无菌操作下，向U 型棒支撑的载玻片上移入2 小块培养基，在中央分别接种青霉、曲霉和镰刀菌，盖好盖玻片轻压勿留气泡。然后用无菌滴管向圆滤纸片上滴加灭菌的20% 甘油，至滤纸完全湿润为止；

（4）培养：26℃~28℃培养3 天后开始观察。

4．菌落形态观察

   制备查氏培养基平板，在平板中央分别接种青霉、曲霉及镰刀菌，26℃~28℃下恒温培养5 天后，观察并比较菌落形态。

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