光电比浊计数法

 一、目的要求
1．了解光电比浊计数法的原理。
2．学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。
二、基本原理
当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出(图15-4)。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用血细胞计数板计数。
光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在400~700nm之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。
（三）器材
1．菌种  酿酒酵母培养液
2．仪器或其他用具  721型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。
（四）操作步骤
1．标准曲线制作
（1）编号  取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。
（2）调整菌液浓度  用血细胞计数板计数培养24小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的1至7号无菌试管中。
（3）测OD值  将1至7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并将OD值填入下表
每管菌悬液在测定OD值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定
(4)以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。
2．样品测定
将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm波长、lcm比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。
各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。
3．根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。
（五）实验报告
l．结果
每毫升样品原液菌数=从标准曲线查得每毫升的菌数×稀释倍数
2．思考题
(1)光电比浊计数的原理是什么?这种计数法有何优缺点?
(2)光电比浊计数在生产实践中有何应用价值?
(3)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度?如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长?
  
   

 

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