PFGE概述

PFGE的作用

 PFGE是目前分子生物学技术在准确性，特异性，分辨率，重复性最好的方法之一。

 染色体DNA经过特异性限制性内切酶的酶切作用，可以产生多条10-800kb的酶切片段，通过片断的多少和大小来比较细菌的同源性。

 根据同源性来推断传染来源和途径；为更好的作好传染病的防治起到一定的作用。

PFGE方法步骤

一、胶块的制备

1、刮取适量新培养的细菌均匀浑浊于含有1ml细胞悬浊液的eppendorf中，调整OD值至4.0。

2、取400 μl CSB于eppendorf管中置37度水浴中孵育5分钟。

3、在水浴管中加于20 μl蛋白酶K（20mg/ml）使其终浓度为0，5mg/ml。

4、在eppendorf管中加入400 μl的1%Seakem Gold（1%SDS），用枪头轻轻混匀。将混合物加入模具，避免产生气泡，室温下凝固10-15分钟。

二、细胞的裂解

1、每管中加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。

2、将以制好的胶块加入管中，使其在液面下，将管子放在54 ℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。

三、洗胶块

1、从水浴摇床中取出管子，倒掉CLB，每管加入15ml预热的纯水，放回50 ℃水浴摇床中，摇15分钟。

2、倒掉水，用纯水再洗一次。

3、倒掉水，加入15ml预热的TE，放回50 ℃水浴摇床中，摇15分钟。

4、倒掉TE，用TE重复洗4次，每次15分钟。

5、倒掉TE ，加入10mlTE，放在4 ℃冰箱保存备用。

四、酶切

1、小心取出TE中的胶块放干净的培养皿上。用刀片切2mm宽的胶块放入含200μl稀释液的eppendorf管中。放37 ℃水浴中孵育10-15分钟。

2、枪头吸出稀释液，避免损伤胶块。加入200μl酶切液，并确保胶块在液面下。放37 ℃水浴中孵育至少2小时。

五、加样

1、制胶。

2、 从37 ℃水浴中取出管子，平衡到室温。吸出酶切液，加入200μl0.5 ☓TBE平衡。

3、用小铲将胶块加入加样孔中。并用溶化的胶封闭加样孔。

六、电泳

1、电泳槽中加入2.2L 0.5 ☓TBE，盖好盖子。

2、打开主机和泵的开关。

3、打开冷凝机，确保温度在14℃。

4、把胶放入电泳槽，设置电泳参数。

5、关机。

七、分析结果

读胶，获取图像。

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