LGG益生菌的检测

1适用范围：适用于定量分析LGG纯菌种及LGG乳制品中的LGG菌数量。

2定义：LGG是一种鼠李糖乳杆菌菌株(ATCC 53103)，革兰氏阳性，过氧化物酶阴性，棒状，链形，不发酵乳糖，对万古霉素有抗性。

3原理：样品经稀释剂稀释后均质，然后按10倍的稀释倍数接种到选择性琼脂培养基中，厌氧培养，计数所有的菌落，结果以cuf/g计。

注：培养过程中，所有万古霉素抗性的菌株都会生长（比如所有的鼠李糖乳杆菌，干酪乳杆菌，胚芽乳杆菌等）。但是，由于LGG不发酵乳糖，所以可以很容易地区分开来。进一步分析鉴定则可采用基因的方法。

4仪器和玻璃器皿

只要规格可以满足要求，采用一次性或可重复使用的仪器均可。除了微生物实验室所常用的仪器外，下列仪器是必需的：

烘箱；    高压杀菌锅；   培养箱（37℃±1℃）；      水浴（44-47℃）；

混合器（Peristaltic-type）；带有无菌塑料袋；        天平。

5培养基和试剂

5.1 稀释液准备

蛋白栋1.0g；        氯化钠8.5g；      去离子水1000mL。

若需要，可缓慢加热至完全溶解。将溶液分至一些瓶子中，然后在高压杀菌锅中进行杀菌（121℃±1℃，15分钟）。杀菌后，溶液pH7.0±0.2。

每个瓶子均可在常温下贮存半年。

5.2 培养基

5.2.1 MRS琼脂培养基：适用于纯LGG菌种检测。高压杀菌后pH6.4±0.2,4-6℃条件下可贮存6个月。

5.2.2 MRS-万古霉素琼脂培养基（MRS-V）：适用于LGG菌种与普通酸奶菌种混合后的检测。万古霉素50mg/L, 可以在高压杀菌前加入，也可以作为无菌滤液加入琼脂中。

5.2.3 MRSL肉汤培养基（检测乳糖发酵特性）

分别溶解于5-10mL乙醇中，然后加入肉汤中。取5mL试样，高压杀菌（121℃±1℃，15分钟）后作测试用。杀菌后，溶液pH7.2±0.2。

6步骤

6.1 样品制备

样品制备前，先放置于室温下1-2小时，以使其温度与室温相同。称取10g样品于无菌塑料袋中，加入90ml无菌蛋白胨-氯化钠水溶液。将塑料袋放入混合器中混合60秒，以确保悬浮液均匀一致。这是第一个稀释10倍的样液，该溶液必须继续按10倍的倍数进行稀释，且必须在15分钟内将各样液接种到培养皿中。

6.2 在选择性琼脂培养基中接种

选择合适的琼脂培养基：纯菌种用MRS琼脂培养基，混合菌种用MRS-万古霉素琼脂培养基。取1mL（倾倒法，即Pour-plate method）或0.1mL（涂抹法，即spread-plate method）每一稀释度的样液分别接种到两个培养皿中，琼脂的温度应为44-47℃，然后于厌氧条件下进行培养（37±1℃，72±6小时）。

6.3 菌落计数

计数那些LGG菌落在10-300之间的培养皿。LGG菌落特征：光滑、大、白色、圆形或椭圆形、边缘清晰。

6.4 确认实验

为了进一步确认菌落是否为LGG，可从菌落中挑取一些纯菌种，进行显微镜观察和乳糖发酵实验（MRSL肉汤）。做乳糖发酵实验时，将挑取的纯菌种接种到肉汤培养基后，有氧培养（37±1℃，1-2天）。由于LGG不发酵乳糖，故肉汤应是紫色的（未变色）。而若是能够利用乳糖的微生物，则肉汤变为黄色。实验时，利用纯LGG菌种和任一能够利用乳糖的其它菌种进行对照实验。

7结果          以每克样品中LGG的菌落数表示，即cfu/g。

8注意事项：

1）、制备培养基，灭菌前可将万古霉素加到MRS-A培养基中混均，按照培养基标签上使用说明进行灭菌；

2）、检样前需将样品在室温下放置1-2小时，使其温度与室温相同，称取样品时应将包含LGG益生菌的部分接入稀释液中，混匀进行接种；

3）、根据样品特性，接种稀释倍数可选择10-4和10-5，每个稀释度分别接种两个平皿；

4）、样品制备完毕，将各样液接种到培养皿，倾倒温度为44-47℃培养基，整个操作过程必须在15分钟内完成，同时做琼脂空白试验；

5）、待琼脂凝固后，翻转平皿放入厌氧罐，再放入厌氧测试条，然后放入产气袋，产气袋放入后应立即将盖盖严，避免产气袋在空气中暴露时间过长；

6）、检样放入厌氧罐后在规定的培养条件下进行培养，并随时观察厌氧测试条颜色变化情况（无氧为白色，有氧时为粉色），保证培养条件完全达到无氧状态；放入测试条时注意不要靠壁，使其处于自然状态。（一般在放入培养箱后3-5小时后观察，如测试条颜色发生变化，应再放入产气袋重新进行测试）。

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