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LGG益生菌的检测



录入时间:2015-5-7 14:54:43 来源:青岛海博生物

1适用范围:适用于定量分析LGG纯菌种及LGG乳制品中的LGG菌数量。

2定义:LGG是一种鼠李糖乳杆菌菌株(ATCC 53103),革兰氏阳性,过氧化物酶阴性,棒状,链形,不发酵乳糖,对万古霉素有抗性。

3原理:样品经稀释剂稀释后均质,然后按10倍的稀释倍数接种到选择性琼脂培养基中,厌氧培养,计数所有的菌落,结果以cuf/g计。

注:培养过程中,所有万古霉素抗性的菌株都会生长(比如所有的鼠李糖乳杆菌,干酪乳杆菌,胚芽乳杆菌等)。但是,由于LGG不发酵乳糖,所以可以很容易地区分开来。进一步分析鉴定则可采用基因的方法。

4仪器和玻璃器皿

只要规格可以满足要求,采用一次性或可重复使用的仪器均可。除了微生物实验室所常用的仪器外,下列仪器是必需的:

烘箱;    高压杀菌锅;   培养箱(37℃±1℃);      水浴(44-47℃);

混合器(Peristaltic-type);带有无菌塑料袋;        天平。

5培养基和试剂

5.1 稀释液准备

蛋白栋1.0g;        氯化钠8.5g;      去离子水1000mL。

若需要,可缓慢加热至完全溶解。将溶液分至一些瓶子中,然后在高压杀菌锅中进行杀菌(121℃±1℃,15分钟)。杀菌后,溶液pH7.0±0.2

每个瓶子均可在常温下贮存半年。

5.培养基

5.2.1 MRS琼脂培养基:适用于纯LGG菌种检测。高压杀菌后pH6.4±0.2,4-6℃条件下可贮存6个月。

5.2.2 MRS-万古霉素琼脂培养基(MRS-V):适用于LGG菌种与普通酸奶菌种混合后的检测。万古霉素50mg/L可以在高压杀菌前加入,也可以作为无菌滤液加入琼脂中。

5.2.3 MRSL肉汤培养基(检测乳糖发酵特性)

 

分别溶解于5-10mL乙醇中,然后加入肉汤中。取5mL试样,高压杀菌(121℃±1℃,15分钟)后作测试用。杀菌后,溶液pH7.0.2

6步骤

6.1 样品制备

样品制备前,先放置于室温下1-2小时,以使其温度与室温相同。称取10g样品于无菌塑料袋中,加入90ml无菌蛋白胨-氯化钠水溶液。将塑料袋放入混合器中混合60秒,以确保悬浮液均匀一致。这是第一个稀释10倍的样液,该溶液必须继续按10倍的倍数进行稀释,且必须在15分钟内将各样液接种到培养皿中。

6.2 在选择性琼脂培养基中接种

选择合适的琼脂培养基:纯菌种用MRS琼脂培养基,混合菌种用MRS-万古霉素琼脂培养基。取1mL(倾倒法,即Pour-plate method)或0.1mL(涂抹法,即spread-plate method)每一稀释度的样液分别接种到两个培养皿中,琼脂的温度应为44-47℃,然后于厌氧条件下进行培养(37±1℃,72±6小时)。

6.3 菌落计数

计数那些LGG菌落在10-300之间的培养皿。LGG菌落特征:光滑、大、白色、圆形或椭圆形、边缘清晰。

6.4 确认实验

为了进一步确认菌落是否为LGG,可从菌落中挑取一些纯菌种,进行显微镜观察和乳糖发酵实验(MRSL肉汤)。做乳糖发酵实验时,将挑取的纯菌种接种到肉汤培养基后,有氧培养(37±1℃,1-2天)。由于LGG不发酵乳糖,故肉汤应是紫色的(未变色)。而若是能够利用乳糖的微生物,则肉汤变为黄色。实验时,利用纯LGG菌种和任一能够利用乳糖的其它菌种进行对照实验。

7结果          以每克样品中LGG的菌落数表示,即cfu/g

8注意事项:

1)、制备培养基,灭菌前可将万古霉素加到MRS-A培养基中混均,按照培养基标签上使用说明进行灭菌;

2)、检样前需将样品在室温下放置1-2小时,使其温度与室温相同,称取样品时应将包含LGG益生菌的部分接入稀释液中,混匀进行接种;

3)、根据样品特性,接种稀释倍数可选择10-4和10-5,每个稀释度分别接种两个平皿;

4)、样品制备完毕,将各样液接种到培养皿,倾倒温度为44-47℃培养基,整个操作过程必须在15分钟内完成,同时做琼脂空白试验;

5)、待琼脂凝固后,翻转平皿放入厌氧罐,再放入厌氧测试条,然后放入产气袋,产气袋放入后应立即将盖盖严,避免产气袋在空气中暴露时间过长;

6)、检样放入厌氧罐后在规定的培养条件下进行培养,并随时观察厌氧测试条颜色变化情况(无氧为白色,有氧时为粉色),保证培养条件完全达到无氧状态;放入测试条时注意不要靠壁,使其处于自然状态。(一般在放入培养箱后3-5小时后观察,如测试条颜色发生变化,应再放入产气袋重新进行测试)。

 

 

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