转基因食品的检测技术

一、概述

    转基因食品又称遗传修饰食品（genetically modified food），简称GMF或GM食品。转基因食品大体上分为如下三类。

（1）转基因植物食品  由转基因植物如转基因的玉米、大豆、水稻、马铃薯、番茄、香蕉、苹果、菠菜等生产加工而成。

（2）转基因动物食品  如转基因的鱼、鸡、牛、羊等。目的主要通过导入外源基因或对自身基因加以修饰来使受体动物降低结缔组织交联度、改善肉质．或使受体生物个体肥大，或生产营养价值高的蛋、肉、乳等。

（3）转基因微生物食品  如转基因微生物发酵而制得的葡萄酒、啤酒、酱油等，此类食品是利用转基因微生物（如转基因酵母和酶）的作用而生产出来的食品。后两类转基因食品目前在市场上还很少。

（一）ELISA技术与转基因食品检测

 l.ELISA基本原理

   建立在抗体抗原免疫学反应的基础上。 

   ELISA分析法必须具备待检测的固定相抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物三种试剂，且满足两个前提条件：

   待检测的抗原或抗体能够结合到不溶性载体表面并保持活性；

   标记酶能与抗原或抗体结合并同样 保持各自生物活性。

ELISA分析基本步骤如下：①将抗原（Ag）或抗体Ab结合到固相载体平板的孔里；②待测溶液的特殊抗原或抗体结合到敏化载体表面；③加入酶标抗体使之与抗原或抗体化合物相结合；④结合物通过标记酶催化底物的颜色改变而被检测；⑤通过最后溶液的颜色深浅对待侧抗原或抗体进行定量分析。

2.ELISA分析法的灵敏度

3.ELISA分析法的要点

  特异性高，获得结果快，仪器简单，易于操作，对人员要求不高。免却了对样品进行核酸提取的麻烦，同时可降低检测的成本，由于酶既有很高的催化效率，可极大的放大反应效果，从而使测定达到很高的灵敏度和稳定性。

(二）PCR技术与转基因食品的检测

 1.PCR技术对转基因食品的定性检测

（1）PCR基本原理  PCR技术由美国Centus公司Kary Mullis发明，20世纪90年代逐渐成熟应用。简单地说PcR就是利用核酸DNA聚合酶、引物和4种脱氧单核苷酸在试管内完成模板DNA的快速复制． 

（2）PCR技术检测转基因食品的技术关键和理论依据 

（3）PCR检测转基因食品的基本步骤  

        ①待检材料DNA提取：通常利用CTAB法从食品材料中提取核酸；

        ②PCR反应：设计合适引物。PCR扩增待检样品中的靶标DNA；

        ③观测PCR产物：通过凝胶电泳分析将PCR产物展现；

        ④确定结果：有时为了避免假阻性，还需要对PCR产物进行限制性酶切分析进行质量控制。

2.PCR技术对转基因食品的定量检测

  目前基于GMO特异DNA片段的定性PCR筛选方法已广泛应用于GMO食品检测．但是随着各国有关GMO标签法的建立和不断完善，对食品中的GMO含量的下限已有所规定。为此，研究者在定性筛选PCR方法的基础上发展了不同的定量GMO的PCR检测方法。目前，国外较为成熟的方法主要有半定量PCR法、定量竞争PCR(Quantitative competitive PCR)和Real—time PCR(实时定量PCR)法等三种。

（1）半定量PCR法 

①样品DNA的提取和定量。

  按常规方法提取DNA后，取部分样品DNA在0.8％琼脂糖凝胶中电泳，与已知古量的Marker比较，用计算机凝腔成像分析系统处理结果，以确定所提取的DNA量。例如，一般700mg的玉米粉可提取lμg DNA。

②PCR反应。

       a.样品DNA的质量分析

       b.建立内部参照反应体系

       c.测定CaMV35S启动子的定量PCR反应

（2）定量竞争PCR法   PCR反应实质是对特定模板DNA的指数扩增放大，而在相同的条件下，获得DNA的量与最初模板DNA的浓度成正相关，竞争定量PCR就是依据这种扩增DNA与模板DNA之间的浓度相关性设计的。基本原理是先构建含有修饰过的内部标准DNA片段(竞争DNA)，竞争DNA由质粒组成，带有一个改造PCR扩增子，改造部分可以是DNA插人序列、缺失序列或者点突变，竞争DNA与待测目标DNA在同一反应管中进行PCR共扩增，因竞争DNA片段和待测DNA的大小不同，经琼脂糖凝胶可将两者分开，通过比较两种条带的量可进行定量分析。

（三）生物芯片与转基因产品检测

    就目前转基因食品检测中常用的ELISA和PCR技术而言，最大的缺点是检测范围窄，效率低，无法高通量大规模地同时检测多种样品，尤其是对转基因背景一无所知的情况下。对各种候选待检基因序列或蛋白的逐一筛查几乎是不可能的。而目前正在研究的转基因产品所涉及的基因数量有上万种，今后都有可能进入商品化生产，显而易见对进出口产品的检测，需要有更有效的、快速、特别是高通量的检测方法，最近几年出现的生物芯片技术能较好地解决这一问题。生物芯片根据所载探针种类分为基因芯片和蛋白质芯片两大类：基因芯片以DNA为探针。依据核酸杂交的原理检测样品中的特定基因序列；蛋白质芯片以蛋白质为探针，依据抗原抗体反应的免疫学原理检测样品中的特定蛋白质。

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