一、实验目的和内容
目的：学习和掌握环状沉淀反应及双向琼脂扩散沉淀反应方法。
内容：1. 用牛血清白蛋白及兔抗牛血清白蛋白，进行环状沉淀反应。
2. 用以上抗原和抗体进行双向琼脂扩散沉淀反应试验。
二、实验材料和用具
可溶性抗原(牛血清白蛋白)、兔抗牛血清白蛋白抗血清、生理盐水(0.85%NaCl)。
洗净载玻片、小试管、移液管、玻璃毛细吸管、不锈钢吸管。
三、操作步骤
(一)环状沉淀反应
1. 取1：25的牛血清白蛋白lmL，用生理盐水以对倍稀释法稀释成1：50，1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200的抗原溶液。
2．取9支洁净干燥的小试管，每支小试管如入1：2的兔抗牛血清白蛋白抗血清0.5mL。
3，用移液管吸取上面已稀释好的牛血清白蛋白(抗原)，按表21—1要求，从最大稀释度开始，沿着管壁徐徐加入各小试管中，使与下层抗体之间形成交界面，切勿摇动混匀，第8管加入生理盐水及第9管加入兔抗血清以作对照。
4．静置15~30min，观察在两液面交界处有无白色环状沉淀物出现。
5．结果记录 凡有白色环状沉淀物者记“+”，没有沉淀者记“-”。最大稀释度的抗原与抗体交界面之间还出现白色环状沉淀者，此管的抗原稀释倍数即为抗体(沉淀素)的效价。
表21-1环状沉淀反应记录表
(二)双向琼脂扩散沉淀反应
1．称取1g优质琼脂于l00mL pH7.2生理盐水中，在沸水中水浴使琼脂溶化后，加入1%的硫柳汞lmL防腐。每块载玻片(7.5cm×4.5cm)滴加4mL琼脂溶液，待凝固后用不锈钢吸管在两端(A、B端)打梅花形小孔，孔径和孔距均为3mm。亦可直接用不锈钢管打孔，再用接种针挑去梅花形孔中的琼脂块。
2．在A端梅花形孔中，用玻璃毛细吸管在中心孔中加入适当稀释的抗血清(抗体)，注意要使孔加满，但不外溢；周围孔加入不同稀释度的抗原(例如1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320)。
在B端梅花形孔中，同样在中央孔中加入适当稀释度的抗原，周围的孔中加入不同稀释度的抗体。
3．把以上载玻片放入带盖的铝盒中，下面垫上3一4层湿纱布，置37℃扩散24～48h，可看见抗原和抗体反应处呈现的沉淀线。
4．记录结果 注意沉淀线数目及偏向。
四、注意事项
1．在进行环状沉淀反应试验时，一定要沿着管壁加入抗原，而且切勿摇动，否则影响沉淀环的形成。
2．双向琼脂扩散试验时，抗原或抗体的稀释度多少才合适，教师必须进行预测，否则由于抗原、抗体比例不合适而造成假阴性。
五、演示
1. 沿着管壁徐徐加入抗原的操作。
2. 在琼脂板上打梅花孔的操作。
六、实验报告
记录环状沉淀反应的结果并确定抗体的效价。
按照表21-2和表21-3记录双向琼脂扩散结果，并分析寻找其规律性。
表21-2载玻片A端结果
七、问题和思考
1．比较凝集反应与沉淀反应有何异同？
2．双向琼脂扩散沉淀反应试验中，抗原或抗体浓度大于相应抗体或抗原时，沉淀线会出现何种现象？为什么会出现多条沉淀线？
3．如发现衣服上有一血迹，怀疑是人血，你能用简单的方法进行鉴定吗？并叙述其方法步骤
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