细菌的镜检

细菌的镜检的项目有细菌的形态、大小、革兰氏染色反应，有无芽孢、荚膜、鞭毛以及细胞运动情况等。

1、细菌的制片方法：在镜检前必须将被检物制成玻片标本，才能观察，用于标本的玻片应非常干净。

根据被检物所要检查的项目和供检材料的不同，其制片方法有以下三种：

①普通法（压片法）：用普通法制作活细菌标本，不但便于观察细菌的运动，而且还能观察细菌的形状、大小和芽孢。其方法是：在干净的载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环挑取一环供检材料放入水中并混匀，若供检材料为液体而不太浓时，则不必加水。然后加放盖玻片，在盖片时，应先把盖片的一端放在载玻片上，再慢慢向下压盖，勿使水从该玻片边缘溢出。同时避免发生气泡，然后用干净的玻璃棒等使盖片紧贴在载玻片上。

为了便于观察，可用美蓝或复红等染色液代替谁使用，将细菌染成蓝色或红色，然后把盖玻片盖上，在进行镜检，这样看的较为清晰。

②悬滴法：悬滴法用于观察生活状态的细菌，如细菌的运动、繁殖方式、孢子萌发等。其方法是：取一滴蒸馏水或培养液于干净的盖玻片中央，再取一环培养好的菌体，接种于盖玻片的液滴中，然后将盖玻片翻转过来，盖于凹玻片的凹窝中，使菌液正好倒垂在载玻片的凹窝中央，不要使水滴碰到凹窝的壁和底。为防止干燥，在盖玻片边沿上涂上凡士林，使菌液紧紧处在密闭的小室中，即可镜检。因为没有染色的活细菌是透明的，不易看到，必须降低聚光器或缩小光圈，以减少照明强度，认真观察，才能得到良好效果，若观察其繁殖或孢子萌发时，需将带有悬滴的玻片放在底部铺有湿纸或湿棉的培养皿中，以便保湿，盖好皿盖进行定温培养，而后镜检。

③涂片法：涂片法适用于细菌结构的观察，其方法是：首先在干净的载玻片中央加一滴蒸馏水，用灭菌的接种环取少许菌体，放在载玻片上，与水混合涂成直径约为1cm的均匀薄片，即成涂片。用这种涂片法制的标本在显微镜下一般不直接看，经染色后才能看得清晰。

2、细菌的染色方法：由于细菌个体透明，在光学显微镜下不易观察到其形态，必须借助于染色的方法使菌体着色，增加与背景的明暗对比，才能在光学显微镜下较为清楚地观察其个体形态和部分结构。

按照所用染料种类的不同，可将染色法分成两大类：单染色法和复染色法。

单染色法又称普通染色法，只用一种染料染色，适用于菌体一般形态观察。操作过程为：按涂片法制成的涂片，进行固定，固定方法有自然干燥或加温干燥。通常采用加温固定，可在酒精灯火焰上快速来回烘烤涂片背面，以手摸载片发烫时为宜。在固定好的玻片上加染色液1~2滴（吕氏美蓝或碱性复红液），使其盖满玻片，静止1~2min。用细小水流慢慢冲去染料，再用吸水纸吸去玻片上的水分，待晾干后即可镜检。

复染色法（革兰氏染色法）又称鉴别染色法，是用两种或多种染料进行染色，有帮助鉴别细菌之用。最常用的为革兰氏染色法。染色结果，菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌（G+），红色者为革兰氏阴性菌（G-）

其操作步骤如下：

①涂片固定：取培养24~48h的细菌按单染色法涂片固定。

②初染：滴加结晶紫液，全部覆盖于涂片上，染色1min后，用细水流冲洗，而后用吸水纸轻轻吸干。

③媒染：加路氏碘液，1min后水洗，同样用吸水纸吸干。路氏碘液是一种媒染剂，具有助染作用。

④脱色：加95%（体积分数）酒精经10~30秒后，水洗，同样用吸水纸吸干。

⑤复染：加石炭酸复红液染0.5min后，水洗，吸干。即可在油镜下镜检。

在进行革兰氏染色过程中，以涂片和酒精脱色这两步最为关键。涂片切不可过于浓厚，要求薄而均匀。过于密集的细菌涂片常常影响脱色结果，而呈现假阳性反应。95%（体积分数）酒精，这种脱色剂，脱色能力很强，所以要求脱色时应恰当掌握。脱色过轻，阴性菌脱色不掉紫色会造成假阳性；若脱色过重，阳性菌的紫色也会被脱掉而造成假阴性。

此外，革兰氏染色的结果还与菌龄有关。一般幼龄菌的革兰氏染色反应比较正常，老龄菌的革兰氏染色反应常有变化，特别是革兰氏阳性菌，在老龄时常是阴性反应。因此，革兰氏染色所用的菌种一般是24~48h的培养物。

3、细菌芽孢、荚膜、鞭毛染色法：细菌芽孢染色法：芽孢染色法是利用细菌和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别，芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红，在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢。进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再用复染液（如番红液）或衬托液（如黑色素）处理，则菌体和芽孢易于区分。其操作过程如下：

①将培养24h左右的芽孢杆菌作涂片、干燥、固定。

②滴加3~5滴孔雀绿染色液于已固定的涂片上。

③用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽，但勿沸腾。切忌时染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽开始约4~5min。

④倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。

⑤用番红水溶液复染1min，水洗。

⑥待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌呈红色。

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