海博微信公众号
海博天猫旗舰店
海博微信公众号
海博天猫旗舰店
生淀粉糖化酶一般指可以直接作用、水解或糖化未经蒸煮的淀粉颗粒的酶，可能包括α-淀粉酶、β淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、普鲁兰酶。它可以将淀粉传统工艺中的糊化、液化和糖化合并为一步直接进行糖化，如果将其应用于无蒸煮的酒精发酵，可节约总能耗的30%~40%。已发现的能产生淀粉酶的微生物种类较多，报道最多的是黑曲霉、根霉和芽孢杆菌。本文筛选出能产生淀粉酶的细菌，对其进行初步鉴定，并进行了酶学性质的研究。
1 材料与方法
1.1 土样
校内食堂垃圾附近的土壤。
1.2 培养基
平板分离培养基：可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH7.2~7.4,121℃灭菌20min。其中可溶性淀粉在105℃下干热灭菌2h，然后在65℃下无菌操作加入。
液体发酵培养基：可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸馏水1000ml，pH7.2~7.4,121℃灭菌20min。其中可溶性淀粉在105℃下干热灭菌2h，然后在常温下无菌操作加入。
1.3 菌种筛选方法
初筛：变色圈法，选择圈径比较大的菌落，进一步划线分离后，进行产酶测定。
复筛：测酶活，选择酶活高的菌株作为目的菌株。
1.4 生淀粉酶活的测定方法
酶活力测定方法：将发酵液在4℃，8000r/min下，离心30min后取出上清液，再通过抽滤得到的滤液为粗酶液，取1ml粗酶液，加入到19mLpH6.5的柠檬酸盐缓冲液中，再加入0.5g的可溶性淀粉为底物，30℃水解2h后用0.5ml4%的NaOH溶液终止反应，反应液在4000r/min下离心5min，用DNS法测定上清液中还原糖的含量，测定540nm处的吸光度（在酶活测定体系中，以纯水取代粗酶液作为空白），查葡萄糖标准曲线得到水解产物中的葡萄糖量，从而确定生淀粉酶的酶活力大小。
酶活力定义：在pH6.5、温度为30℃保温120min条件下，1min产生1ug葡萄糖所需要的酶的量规定为1个酶活力单位（U）。
1.5 菌种鉴定
进行形态和生理生化检测。
1.6 生淀粉糖化酶的酶学性质研究
1.6.1 酶的热稳定性研究 取一定量的粗酶液，分别在50℃、60℃、70℃和80℃不同温度下保温60min，每隔10min测定残留酶活力。
1.6.3 pH的影响 配制pH分别为3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0、7.6、8.0和8.6的柠檬酸盐缓冲液，在不同pH缓冲液中让酶水解生淀粉，通过水解产物中葡萄糖的量计算酶活力的大小。
1.6.4 酶的pH稳定性研究 将酶溶于pH6.5的柠檬酸盐缓冲液中，分别放置1、2、4、6、9、12、24、36、48和60h后，测定残余物的酶活力大小。
1.6.5 金属离子的影响 以不加金属离子为对照，分别在反应液中加入1mmol/L的Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Zn2+和Cu2+，测定酶活。
2 结果与分析
2.1 菌种筛选
从初筛平板上挑出了8株有较大淀粉水解圈的菌株，分别编号为QD001到QD008。测得它们各自的圈径比见表1，对圈径比较大的菌株QD001、QD006和QD007做斜面保藏并通过摇瓶复筛，得到QD006酶活力最高，达到10、18U/ml，确定为目标菌株。
2.2 菌种鉴定
QD006的菌落较小，较薄，较透明且“细腻”，边缘光滑，革兰氏染色确定该菌为革兰氏阳性菌，经显微观察呈球形，为球菌；糖类发酵试验显示改菌能利用葡萄糖，蔗糖，但不能利用乳糖：VP试验为阴性；MR试验为阴性；吲哚试验为阴性；柠檬酸盐为阴性。初步鉴定该菌为Staphylococcus intermedius。
2.3生淀粉糖化酶的酶学性质
2.3.1 温度对酶活的影响
由图1可知，酶的最适作用温度为50℃。当温度小于50℃时，反应速率随温度升高而升高，但高于最适温度，酶的反应速率下降。
2.3.2 生淀粉糖化酶的热稳定性
由图2可知，该生淀粉糖化酶在50℃和60℃时，放置1h后，残余酶活分别是99.8%和98.2%，由此可知，在60℃内，该生淀粉糖化酶具有很好的热稳定性。
2.3.3 pH对酶活力的影响
由图3可知，该酶的最适为6.5左右，同时可以看出pH在3-4.5的范围内，生淀粉糖化酶的酶活变化不大，上升趋势比较小，但pH对生淀粉糖化酶的影响呈现出明显的钟罩形。
2.3.4 酶的耐酸稳定性
由图4可知，该生淀粉糖化酶在pH6.5的柠檬酸盐缓冲液中放置1、2、5h后，残余的酶活力都在70%以上，随着放置时间的延长，酶活力迅速降低，放置60h，残余的酶活力仅在10%左右，所以该酶的耐酸稳定性比较弱。
2.3.5 金属离子对生淀粉糖化酶的酶活力的影响
由表2可知，Ca2+、Na+、K+、对该生淀粉糖化酶有激活作用，Fe3+、Zn2+、Cu2+ 对该酶有抑制作用。
3 结论
从自然界分离得到产生淀粉酶的菌株QD006，通过形态和生理生化鉴定，初步确定为Staphylococcus intermedius，经对该酶酶学性质的研究，其最适温度为50℃，最适pH为6.5，并且具有良好的热稳定性，Ca2+、Na+、K+、对该生淀粉糖化酶有激活作用，Fe3+、Zn2+、Cu2+ 对该酶有抑制作用。
| 相关文章: |
