食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验

1 范围

本标准规定了食品中阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）的检验方法。

本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎肠杆菌的检验。

2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1 恒温培养箱：25 ℃±1 ℃，36 ℃±1 ℃，44 ℃±0.5 ℃。

2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.3 恒温水浴箱：44 ℃±0.5 ℃。

2.4 天平：感量0.1 g。

2.5 均质器。

2.6 振荡器。

2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

2.8 无菌锥形瓶：容量100 mL、200 mL、2000 mL。

2.9 无菌培养皿：直径90 mm。

2.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

2.11 全自动微生物生化鉴定系统。

3 培养基和试剂

3.1 缓冲蛋白胨水（buffer peptone water，BPW）：见附录A 中A.1。

3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin

medium，mLST-Vm）：见附录A 中A.2。

3.3 阪崎肠杆菌显色培养基。

3.4 胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar，TSA）：见附录A 中A.3。

3.5 生化鉴定试剂盒。

3.6 氧化酶试剂：见附录A 中A.4。

3.7 L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.5。

3.8 L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.6。

3.9 L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A 中A.7。

3.10 糖类发酵培养基：见附录A 中A.8。

3.11 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A 中A.9。

第一法阪崎肠杆菌的检验

4 检验程序

阪崎肠杆菌检验程序见图1。

 

 

 

5 操作步骤

5.1 前增菌和增菌

取检样100 g（mL）加入已预热至44 ℃装有900 mL 缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36 ℃±1 ℃培养18 h±2 h。移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤，44 ℃±0.5 ℃培养24 h±2h。

5.2 分离

5.2.1 轻轻混匀mLST-Vm 肉汤培养物，各取增菌培养物1 环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。

5.2.2 挑取1 个～5 个可疑菌落，划线接种于TSA 平板。25 ℃±1 ℃培养48 h±4 h。

5.3 鉴定

自TSA 平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。阪崎肠杆菌的主要生化特征见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。

第二法 阪崎肠杆菌的计数

7 操作步骤

7.1 样品的稀释

7.1.1 固体和半固体样品：无菌称取样品100 g、10 g、1 g 各三份，加入已预热至44 ℃分别盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中，轻轻振摇使充分溶解，制成1:10 样品匀液，置36 ℃±1 ℃培养18 h±2 h。分别移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤，44 ℃±0.5 ℃培养24 h±2 h。

7.1.2 液体样品：以无菌吸管分别取样品100 mL、10 mL、1 mL 各三份，加入已预热至44 ℃分别盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中，轻轻振摇使充分混匀，制成1:10 样品匀液，置36 ℃±1 ℃培养18h±2h。分别移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤，44 ℃±0.5 ℃培养24 h±2 h。

7.2 分离、鉴定

同5.2，5.3。

8 结果与报告

综合菌落形态、生化特征，根据证实为阪崎肠杆菌的阳性管数，查MPN 检索表，报告每100 g（mL）样品中阪崎肠杆菌的MPN 值（见附录Ｂ中表B.1）

附录A

（规范性附录）

培养基和试剂

A.1 缓冲蛋白胨水（BPW）

A.1.1 成分

蛋白胨 10.0g

氯化钠 5.0 g

磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 9.0 g

磷酸二氢钾 1.5 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 7.2

A.1.2 制法

加热搅拌至溶解,调节pH，121 ℃高压灭菌15 min。

A.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium，mLST-Vm）

A.2.1 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨（mLST）肉汤

A.2.1.1 成分

氯化钠 34.0 g

胰蛋白胨 20.0 g

乳糖 5.0 g

磷酸二氢钾 2.75 g

磷酸氢二钾 2.75 g

十二烷基硫酸钠 0.1 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.2.1.2 制法

加热搅拌至溶解，调节 pH。分装每管10 mL，121 ℃高压灭菌15 min。

A.2.2 万古霉素溶液

A.2.2.1 成分

万古霉素 10.0 mg

蒸馏水 10.0 mL

A.2.2.2 制法

10.0 mg 万古霉素溶解于10.0 mL 蒸馏水，过滤除菌。万古霉素溶液可以在0 ℃～5 ℃保存15 天。

A.2.3 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium，mLST-Vm）

每 10 mL mLST 加入万古霉素溶液0.1 mL，混合液中万古霉素的终浓度为10 μg/ mL。

注：mLST-Vm 必须在24 h 之内使用。

A.3 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）

A.3.1 成分

胰蛋白胨 15.0 g

植物蛋白胨 5.0 g

氯化钠 5.0 g

琼脂 15.0 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 7.3±0.2

A.3.2 制法

加热搅拌至溶解，煮沸 1 min，调节pH，121 ℃高压15 min。

A.4 氧化酶试剂

A.4.1 成分

N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0 g

蒸馏水 100 mL

A.4.2 制法

少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在 7 d 之内使用。

A.4.3 试验方法

用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10 s 之内未变为紫红色、紫色或深蓝色，则为氧化酶试验阴性，否则即为氧化酶实验阳性。

注：实验中切勿使用镍/铬材料。

A.5 L-赖氨酸脱羧酶培养基

A.5.1 成分

L-赖氨酸盐酸盐（L-lysine monohydrochloride） 5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.5.2 制法

将各成分加热溶解，必要时调节 pH。每管分装5 mL，121 ℃高压15 min。

A.5.3 实验方法

挑取培养物接种于 L-赖氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。

A.6 L-鸟氨酸脱羧酶培养基

A.6.1 成分

L-鸟氨酸盐酸盐（L-ornithine monohydrochloride） 5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.6.2 制法

将各成分加热溶解，必要时调节 pH。每管分装5 mL。121 ℃高压15 min。

A.6.3 实验方法

挑取培养物接种于 L-鸟氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。

A.7 L-精氨酸双水解酶培养基

A.7.1 成分

L-精氨酸盐酸盐（L-arginine monohydrochloride） 5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.7.2 制法

将各成分加热溶解，必要时调节 pH。每管分装5 mL。121 ℃高压15 min。

A.7.3 实验方法

挑取培养物接种于 L-精氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。

A.8 糖类发酵培养基

A.8.1 基础培养基

A.8.1.1 成分

酪蛋白（酶消化） 10.0 g

氯化钠 5.0 g

酚红 0.02 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.8.1.2 制法

将各成分加热溶解，必要时调节 pH。每管分装5 mL。121 ℃高压15 min。

A.8.2 糖类溶液（D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙）

A.8.2.1 成分

糖 8.0 g

蒸馏水 100 mL

A.8.2.2 制法

分别称取 D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖类成分各8 g，溶于100 mL 蒸馏水中，过滤除菌，制成80 mg/mL 的糖类溶液。

A.8.3 完全培养基

A.8.3.1 成分

基础培养基 875 mL

糖类溶液 125 mL

A.8.3.2 制法

无菌操作，将每种糖类溶液加入基础培养基，混匀；分装到无菌试管中，每管 10 mL。

A.8.4 实验方法

挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色。

A.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基

A.9.1 成分

柠檬酸钠 2.0 g

氯化钠 5.0 g

磷酸氢二钾 1.0 g

磷酸二氢铵 1.0 g

硫酸镁 0.2 g

溴百里香酚蓝 0.08 g

琼脂 8.0 g～18.0 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.9.2 制法

将各成分加热溶解，必要时调节 pH。每管分装10 mL，121 ℃高压15 min，制成斜面。

A.9.3 实验方法

挑取培养物接种于整个培养基斜面，36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察结果。阳性者培养基变为蓝色。

附录B

（规范性附录）

阪崎肠杆菌最可能数（MPN）检索表

B.1 阪崎肠杆菌最可能数（MPN）检索表

每100 g（mL）检样中阪崎肠杆菌最可能数（MPN）的检索见表B.1。

 

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