微生物源肉类食品安全的现状分析及检测技术(下)

4 肉类食品中致病性微生物的检测技术

  解决肉类食品安全问题不但可以预防与控制食源性疾病的发生和传播，还可以避免全球贸易扩大食源性疾病的流行，同时也是为了更好的解决世界贸易中存在的技术壁垒。为确保肉类食品安全与贸易，需要大力加强肉类食品检验的力度，建立、健全肉类食品法规，加强食品安全监控，提高检测技术，特别是肉类食品微生物的快速检测技术。

4．1 传统检测方法

  食源性致病菌的常规检测流程为：标本一选择性增菌一选择性增菌一挑单个可疑菌落一分离培养一常规细菌生化鉴定／血清学试验／毒素鉴定一检验报告。显然，这种方法存在周期长(5—6d)、操作繁琐、准确性低、工作量大等缺点 J。

4．2 免疫学方法

  免疫扩散法是最先利用的免疫学方法检．坝0致病微生物的，它主要分为单向免疫扩散试验和双向免疫扩散试验，它们检出灵敏度较低，检测标本需要浓缩，操作量大，因而未能推广。放射免疫法(RIA)的应用将同位素测定的高灵敏性和抗原抗体反应的高特异性有效地结合在一起， 使得其检测的灵敏度和特异性均有所提高而且具有简单、快速的特点。RIAN~]定食品标本不需要浓缩，1～2d之内可出结果。但该方法存在放射性污染和需要专门的防护设备、检测仪器等问题， 也不易推广 。

  免疫荧光技术(IFT)是在将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现特异性的荧光反应，可用来对葡萄球菌、大肠杆菌Ol57：H7、沙门氏菌和单核增生李斯特菌等进行快速检测。王军等建立了养殖大黄鱼病原溶藻弧菌的间接荧光抗体免疫快速检测方法，此方法的主要特点特异性强、敏感性高、速度快。

  酶联免疫吸附法(ELISA)方法是一种敏感、快速、简单的方法，应用较广。ELISA法是将酶分子与抗体分子结合形成酶标记分子。当它与固相免疫吸附剂中相应的抗原或抗体、或抗原抗体结合物相遇时形成酶抗原抗体结合物，加入酶底物，结合物中的酶水解底物，生成有色的反应物，根据颜色的深浅，进行检测。它结合了免疫荧光法和放射免疫测定法两种技术的优点，具有可定量、反应灵敏准确、标记物稳定、适用范围宽、结果判断客观、简便完全、检测速度快以及费用低等特点，且同时可进行上千份样品的分析。Kryinskiand等首次将ELISA用于食品中沙门氏菌的检测，并在应用中不断得以发展，8O年代Padhye~91克隆抗体的ELISA检测大肠杆菌0157：H7，其操作简便、快速、准确。Mansfield等 。。将免疫磁珠分离技术与ELISA联合起来建立一个检测系统，该系统对生鸡肉和饲料的检测限为2×103cfu／25g。由于ELISA对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分；同时对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应，分析分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难。

  免疫印迹法是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。Order[m建立的免疫印迹技术检测食品提取物中的金黄色葡萄球菌的肠毒素，通过电泳使分子量大于肠毒素的葡萄球菌蛋白A与肠毒素分开，从而免除了葡萄球菌蛋白A的影响。

4．3 基因芯片技术

  基因芯片技术是上个世纪末诞生的一项新型生物技术。它是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特异微生物。基因芯片技术理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病菌，也可以用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指标，检测的灵敏度、特异性和快速便捷性都很高，因而在致病原分析检测中有很好的发展前景。周巍” 用不对称PCR技术和基因芯片技术建立了一种准确、快速和高敏感性的检测肉中常见食源性致病菌的方法。Wilson 采用病原体诊断基因和20寡核苷酸藻红素标记探针开发出一套多病原体识别的微阵列，可准确识别1 8种致病性病毒、原核生物和真核生物．

4．4 核酸探针技术

  核酸探针检测技术的依据是核酸杂交，其工作原理是两条碱基互补的DNA链在适当的条件下可以按碱基配对原则，形成杂交DNA分子。已知每个生物的各种性质和特征都是由其所含的遗传基因所决定。通过将微生物的特征基因的一条DNA链进行标记，即可制成DNA探针。Petrone “ 】以LM以hly and inla毒力基因特异的互补序列为探针，杂交检测不同样品来源的李斯特菌，取得了较为理想的结果。

4．5 多重PCR技术

  多重PCR是在常规PCR基础上发展起来的一种新型PCR扩增技术，是在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多条目的DNA片断，采用这一技术可同时检测多种病原微生物。其由于具有高效性、系统性、经济简便性等特点，而在食品检测中得到广泛应用能同时检测多种病原菌的检测。Kawasaki 则应用多重PCR技术同时检测肉类中

的沙门氏菌、李斯特菌和大肠杆菌Ol57：H7，以通用预增菌肉汤(universal preenrichmentbrothUPB)作增菌培养基， 通过增菌后检测敏感性可以达到40cfu／kg。

4．6 生物传感技术

  生物传感技术主要是由生物工程和各种技术学科的相互渗透发展起来的。目前，用于食品毒素检测的生物传感器主要为光学生物传感器，特别是表面等离子激元共振(surface plasmon resonance，SPR)生物传感器的应用。SPR是利用表面等离子激元共振现象和SRP谱峰对金属表面上电解质变化敏感的特点，通过将受体固定在金属膜上，检测其与液相配体的特异性结合。SRP作为一种检测方法，以其使用简单和快速的特点在食品安全领域广泛使用。SRP检测的缺陷是只能同时分析几种物质(少于四种)：不能区分特异的靶物质和芯片表面其他样本的非特异交叉反应物：对于固定的受体，当其发生点突变、化学改变或功能活性改变时，SRP不能将其同完整的分析物加以区分。Homola“ 等应用表面质粒共振生物传感器(SPR)检测肉类食品中的金黄色葡萄球菌肠毒素，并可达到实时监控的目的。

5 展望

  肉类食品放心工程关系到人民群众的切身利益和社会安定，关系到肉类食品行业的健康发展。肉类安全将继续面临着微生物的危害及相关问题的挑战。我们必须认识到肉类食品安全是靠生产者、加工人员、零售商、消费者共同努力来完成的。利用高新技术充分了解肉类常见微生物的特性，严格控制致病微生物的危害，确保肉类食品的安全。

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