海博微信公众号
海博天猫旗舰店
海博微信公众号
海博天猫旗舰店
阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，又名黄色阴沟肠杆菌， 为肠杆菌科肠杆菌属的一个种，1980 年改名为阪崎肠杆菌[1]。阪崎肠杆菌主要危害婴儿，导致脑膜炎、败血症及小肠结肠坏死等；也有小部分成人感染骨髓炎和菌血症的报道，虽然有抗生素的治疗，但总体死亡率高达80 %。目前， 该菌感染源头还不十分清楚，但多数报告表明奶粉是主渠道。
奶粉中阪崎肠杆菌的污染问题引起了FAO/WHO及各国的高度重视。FAO/WHO 于2004 年5 月2 日～5日在日内瓦召开了“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌和其他微生物” 研讨会。会议报告将婴儿配方奶粉中病原微生物分成3 类， 其中阪崎肠杆菌与肠炎沙门氏菌并列被认为A 类病原微生物，即该类病原菌在流行病学和微生物学上都有令人信服的证据表明被污染的婴儿奶粉是婴儿患病的传播媒介和传染源。
我国于2005 年8 月颁布了检验检疫行业标准《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》共分为三个部分，分别规定了分离计数法、普通PCR 法及实时荧光PCR 法，供不同条件的实验室选择使用。
1 材料
1.1 菌株
阪崎肠杆菌ATCC29544、12868、29004。
1.2 试剂
肠杆菌增菌肉汤，MLST 增菌液（每升含有胰酪胨20 g，氯化钠34.22 g，乳糖5.0 g，磷酸氢二钾2.75 g，磷酸二氢钾2.75 g，月桂基硫酸钠0.1 g， 万古霉素10 mg，pH7）； 脑心浸液(bioMérieux)；营养琼脂，显色培养基琼脂（Xα-GlcA），氧化酶试验试剂（bioMérieux）； 细菌全基因组DNA 提取试剂盒，引物：5’-GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA-3’、5’-GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG-3’；PCR 试剂盒，100 bp DNA ladder，琼脂糖，10×loading buffer，5×TBE （Tris54 g，0.5 mol/L EDTA pH8.0 20 mL，硼酸27.5 g，加蒸馏水至1 000 mL）。
1.3 仪器
离心机（Eppendorf, 5417R, Germany）； PCR 扩增仪（MJ Research, PTC-200，American）； 电泳仪(Hoefer,PS3000, American)；凝胶成像仪（Bio-Rad, T2A, Italy）；VITEK 生化鉴定系统。
2 方法
2.1 分离与计数法
取样前消毒样品包装的开启处和取样勺。无菌称取样品100 g 3 份，至2 L 的样品稀释瓶中，加入900 mL预热到45 ℃的灭菌蒸馏水， 振摇使样品充分混匀，36 ℃±1℃培养18 h～22 h。移取增菌液10mL 加入90mLEE肉汤中，36℃±1℃培养18 h～22 h。每份增菌液用接种环接种Xα-GlcA 平板，三区法或四区法划线，以得到单个菌落。将平板置36 ℃±1 ℃培养18 h～22 h。观察平板上阪崎肠杆菌的典型形态：蓝绿色菌落，圆形，直径1 mm～2 mm。挑取可疑菌落， 接种营养琼脂36℃±1℃培养18 h～22 h， 进行革兰氏染色为阴性杆菌，氧化酶试验阴性，用VITEK 生化鉴定系统进行生化鉴定。
2.2 普通PCR 检测法
2.2.1 增菌
无菌称取奶粉试样100 g 3 份， 加到已预热的44 ℃ 900 mL MLST 中，振摇使样品充分混匀后， 44 ℃恒温培养22 h～24 h。在液面1 cm 以下取MLST 增菌液0.2 mL 加到装有5 mL BHI 的小试管中，混匀，36 ℃±1 ℃恒温水浴4 h，水面要高于试管中培养基高度。
2.2.2 模板DNA 提取
取BHI 增菌液1.5 mL，10 000 r/min 离心2 min，尽量倒尽上清液。按细菌基因组DNA 提取试剂盒操作说明书提取模板DNA， 所提取的模板DNA 溶于50 μLTE 中。
同时用煮沸法提取增菌液DNA。BHI 增菌液1.5mL，10 000 r/min 离心2 min， 倒尽上清液沉淀溶于50 μLTE 中，煮沸5 min，10 000 r/min 离心2 min，取上清液备用。
剩余BHI 增菌液36 ℃±1 ℃恒温过夜培养， 以备确证试验使用。
2.2.3 PCR 扩增
反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 进行35 个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃下保存。反应体系见表1。
2.2.4 质控
检测过程中要设阳性对照、阴性对照和空白对照。分别接种阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌到10 mLNB 中，36 ℃±1 ℃过夜培养， 各取1.5 mL 增菌液，离心，提取DNA 模板。阪崎肠杆菌DNA 模板作阳性对照，金黄色葡萄球菌DNA 模板作阴性对照，空白对照加水1 μL。
2.2.5 确证试验
阪崎肠杆菌PCR 扩增产物为282 bp，如果电泳出现阳性条带，则取恒温培养的相应剩余BHI 增菌液接种于阪崎肠杆菌显色培基，参照2.1 分离与计数方法，挑取可疑菌落进行鉴定。
3 结果与讨论
3.1 分离计数法与普通PCR 法检测比较
对50 份进口原料乳粉分离计数法和普通PCR法同时比对检测，以评价两种方法的符合程度，结果见表2。
从表2 中可以看出，两种方法的检验结果完全相符，说明两种方法检验奶粉中阪崎肠杆菌结果均准确、可靠。
通过两种方法比较检测， 虽然检测效果相同，但是比较其检验流程， 如果样品为阴性结果，PCR 方法较分离计数法快2 d；如果检测结果为阳性，PCR 方法较分离计数法可早1 d 得到结果。
同时发现同一标准下不同检测方法的增菌步骤不尽相同，而且由于PCR 方法阳性结果需要分离计数法确认试验，以分离到阳性菌株为最终结果，所以统一增菌步骤，建立一套完整的试验体系，将使试验设计更为严密。
3.2 DNA 提取方法比较
对50 份进口原料乳粉进行普通PCR 法检测时，DNA 提取同时采用试剂盒、煮沸法两种方法进行。结果显示两种方法对BHI 增菌液进行DNA 提取时，试验结果完全相同。分析原因，MLST 及BHI 对阪崎肠杆菌增菌效果很好， 当样品中有阪崎肠杆菌100 CFU/100 g检测在阪崎肠杆菌试验中， 取样量均为3 个100 g。在31 份阳性样品中，3 个100 g 均验出阪崎肠杆菌的样品很少，绝大多数样品只在3 个100 g 中验出其中1份100 g 样品阳性，说明阪崎肠杆菌在乳粉中含量很少， 如果只取100 g 样品进行检测则容易造成漏检。Muytjens 等发现，来自35 个国家的141 种婴儿配方奶粉约14 %含有阪崎肠杆菌，含量从0.36 CFU/100 g 到66.0 CFU/100 g。Nazarowec-White 和Farber 测试了加拿大5 家不同公司的120 罐婴儿配方奶粉， 发现其中6.7 %含有阪崎肠杆菌，阳性样品中阪崎肠杆菌的量通常是0.36 CFU/100 g 所以在检测中取样量一定要充足，定量检测取够333 g，定性检测取样量为300 g，才能防止漏检。尤其是成品婴幼儿配方粉检测更应注意， 虽然Nazarwec-White 和Farber 认为1 000 个阪崎肠杆菌/100 g 为感染限量标准比较合理。而Havelaar和Zwietering 认为含有低量阪崎肠杆菌的奶粉溶液在
时经两步增菌即可到达105 CFU/100 g[4],完全可以达到PCR 检测要求， 任何一种DNA 提取方法均可满足要求，但煮沸法更简单，经济实惠。
3.3 阪崎肠杆菌阳性统计数据分析
阪崎肠杆菌广泛存在于环境和各类食品中，如水、温泉、豆腐、奶酪、咸肉、蔬菜等食品中及医院空气、医疗器械、土壤等环境中[5]。在2005 年开展阪崎肠杆菌检测方法研究中，从鱼粉、狗咬胶及膨化食品中多次验出阪崎肠杆菌。
统计31 株阪崎肠杆菌的VITEK 生化鉴定报告，见表3。
其中7 个生化试验结果具有可变性，但与阪崎肠杆菌的检出地域无关。目前核糖核酸分型及质粒分型已应用于阪崎肠杆菌的分型研究中。该生化试验资料的积累为阪崎肠杆菌进一步深化研究及生化分型奠定基础。37 ℃，大约只要2 h 就能使超过1/1 000 的婴儿患病，因此婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌应该不得检出，要最大限度的防止漏检的发生。
上一篇：食品工厂微生物学检验实验室的建设
