食品微生物学检验 大肠菌群计数 征求意见稿

1 范围

本标准规定了食品中大肠菌群（ Coliforms）计数的方法。

本标准适用于食品中大肠菌群的计数。

2 术语和定义

2.1 大肠菌群 coliforms 
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2 最可能数 most probable number，MPN

基于泊松分布的一种间接计数方法。

3 检验原理

3.1  MPN法

MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

3.2 平板计数法

大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。
4 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
4.1 恒温培养箱： 36 ℃ ±1 ℃。
4.2 冰箱： 2 ℃～5 ℃ 。
4.3 恒温水浴箱： 46℃±1℃ 。
4.4 天平：感量 0.1 g。
4.5 均质器。
4.6 振荡器。
4.7 无菌吸管： 1 mL（具 0.01 mL 刻度）、 10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
4.8 无菌锥形瓶：容量 500 mL。
4.9 无菌培养皿：直径 90 mm。
4.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。
4.11 菌落计数器。
5 培养基和试剂

5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ Lauryl Sulfate Tryptose， LST）肉汤：见附录 A 中 A.1。
5.2 煌绿乳糖胆盐（ Brilliant Green Lactose Bile， BGLB）肉汤：见附录 A 中 A.2。
5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（ Violet Red Bile Agar， VRBA）：见附录 A 中 A.3。
5.4 磷酸盐缓冲液：见附录 A 中 A.4。
5.5 无菌生理盐水：见附录 A 中 A.5。
5.6 无菌 1 mol/L NaOH：见附录 A 中 A.6。
5.7 无菌 1 mol/L HCl：见附录 A 中 A.7。

第一法 大肠菌群 MPN 计数法

6 检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1 。

图1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序

7 操作步骤
7.1 样品的稀释
7.1.1 固体和半固体样品：称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 ,8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器以6次/s～9次/s拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。
7.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。
7.1.3 样品匀液的 pH 值应在 6.5～7.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。

7.1.4 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
7.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用 1 支1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
7.2 初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3
管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤）， 36℃ ±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生， 24 h±2 h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
7.3 复发酵试验（证实试验）
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1 环， 移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（ BGLB） 管中， 36 ℃ ±1℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

7.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按7.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的

MPN值。

第二法 大肠菌群平板计数法

8 检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。

图2 大肠菌群平板计数法检验程序

9 操作步骤

9.1 样品的稀释
按7.1进行。
9.2 平板计数
9.2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
9.2.2 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（ VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 ℃ ±1 ℃培养18 h～24 h。
8.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在 15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落（如菌落直径较典型菌落小）。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm 或更大。

9.4 证实试验
从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内， 36 ℃ ±1 ℃培养 24 h～48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。 
9.5 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g
（ mL）样品中大肠菌群数。例： 10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为： 100×6/10×104/g（ mL）=6.0×105CFU/g（ mL）。

附  录A
培养基和试剂

A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨                           20.0 g
氯化钠                                     5.0 g
乳糖                                       5.0 g
磷酸氢二钾（K2HPO4）                      2.75 g
磷酸二氢钾（ KH2PO4）                     2.75 g
月桂基硫酸钠                               0.1 g
蒸馏水                                     1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.1.2 制法
将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管 10 mL。 121 ℃高压灭菌 15 min。
A.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤
A.2.1 成分
蛋白胨                                      10.0 g
乳糖                                        10.0 g
牛胆粉（ oxgall或oxbile）溶液                200 mL
0.1%煌绿水溶液                              13.3 mL
蒸馏水                                      800 mL
pH 7.2±0.1
A.2.2 制法
将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL（将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL，用蒸馏水补足到1 000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。 121 ℃高压灭菌15 min。
A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
A.3.1 成分
蛋白胨                                     7.0 g
酵母膏                                     3.0 g
乳糖                                       10.0 g
氯化钠                                     5.0 g
胆盐或3号胆盐                             1.5 g
中性红                                     0.03 g
结晶紫                                     0.002 g
琼脂                                       15 g～18 g
蒸馏水                                     1 000 mL
pH 7.4±0.1

A.3.2 制法
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2 min，将培养基冷却至45 ℃～
50 ℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3 h。
A.4 磷酸盐缓冲液
A.4.1 成分
磷酸二氢钾（ KH2PO4）                        34.0 g
蒸馏水                                        500 mL
pH 7.2
A.4.2 制法
贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中， 121 ℃高压灭菌15 min。
A.5 无菌生理盐水
A.5.1 成分
氯化钠                                        8.5 g
蒸馏水                                        1000 mL
A.5.2 制法
称取8.5ｇ氯化钠溶于1000 mL蒸馏水中， 121 ℃高压灭菌15 min。
A.6 1 mol/L NaOH
A.6.1 成分
NaOH                                         40.0 g
蒸馏水                                        1000 mL
A.6.2 制法
称取40 g氢氧化钠溶于1000 mL蒸馏水中， 121 ℃高压灭菌15 min。
A.7 1 mol/L HCl
A.7.1 成分
HCl                                          90 mL
蒸馏水                                       1000 mL
A.7.2 制法
移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL， 121 ℃高压灭菌15 min。

附  录B

大肠菌群最可能数（MPN）检索表

   B.1大肠菌群最可能数（MPN）检索表

每g（mL）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表B.1。

表B.1  大肠菌群最可能数（MPN）检索表

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