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致泻大肠埃希氏菌检验(征求意见稿)(二)


录入时间:2016-2-18 9:14:27 来源:青岛海博生物

附录B

五种致泻大肠埃希氏菌PCR鉴定方法

B.1 试剂和材料

B.1.1  按照表B.1序列在基因合成公司合成引物。

B.1.2  1µL取菌环。

B.1.3  灭菌去离子水。

B.1.4  0.85%灭菌生理盐水

B.1.5  10 mmol/L Tris-HCl1 mmol/L EDTA, pH8.0 TE溶液:量取1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.05 mL、0.5 mol/L EDTA溶液(pH8.01 mL于500 mL烧杯中加入约400 mL去离子水均匀混合将溶液定容500 mL121 ℃高压灭菌15 min,室温保存

B.1.6  1.5 mL Eppendorf管,8联排管和8联排盖(平盖/凸盖

B.1.7  10×PCR反应缓冲液,含840 mmoL Tris-HCl (pH 8.5)500 mmoL KCl

B.1.8   25 mmol/L MgCl2

B.1.9   2.5 mmol/L dNTPs:dATP、dTTP、dGTP、dCTP每种浓度为2.5 mmol/L。

B.1.10  5 U/µL Taq酶。

B.1.11  阳性对照品:包含12对引物扩增的目标DNA序列或者含有目标基因的标准菌株。

B.1.12  50×TAE电泳缓冲液:称量242 Tris-HCl 和 37.2 g Na2EDTA·2H2O于1 L烧杯中加入约800mL去离子水,充分搅拌均匀加入57.1 mL冰乙酸,充分溶解;用NaOH调pH至8.3,加去离子水定容至1 L后,室温保存。使用时稀释50倍即1×TAE电泳缓冲液。

B.1.13  琼脂糖。

B.1.14  溴化乙锭(EB)或其他核酸染料。

B.1.15  6×上样缓冲液。

B.1.16  分子量Marker:至少包含100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp条带。

B.1.17  微量移液器及对应吸头:0.5µL~2µL,2µL ~20µL,20µL ~200µL,200µL~1000µL

B.2 仪器和设备

B.2.1  低温冷冻离心机:控温4℃~8℃,最大转速不小于13000 rpm。

B.2.2  PCR仪。

B.2.3  天平:感量0.01g。

B.2.4  核酸电泳仪,包括电源、电泳槽、制胶槽(长度>10cm)和梳子。

B.2.5  凝胶成像系统或紫外成像仪。

B.2.6  微量加样器:0.5µL~2µL,2µL~20µL,20µL~200µL,200µL~1000µL

B.3 检测步骤

B.3.1  DNA模板准备

B.3.1.1  将平板或斜面上生长的菌落悬浮于200 µL 0.85%灭菌生理盐水中,充分打散形成菌悬液,13000 rpm离心3 min。

B.3.1.2  弃掉上清液,使用1 mL灭菌去离子水充分混匀菌体,于100 °C水浴或者金属浴维持10 min

B.3.1.3  冰浴冷却后,13000 rpm离心3 min,收集上清液,用灭菌去离子水按1:10稀释上清液,取2 µL作为PCR检测的模板。

B.3.1.4  也可用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA,按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行操作;所有处理后的DNA模板在-20°C以下保存备用。

B.3.2  PCR对照

    每次PCR反应使用EPEC、EIEC、ETEC、STEC/EHEC、EAEC标准菌株或阳性对照品作为阳性对照。同时,使用大肠埃希氏菌ATCC 25922作为阴性对照,使用灭菌去离子水作为空白对照,控制PCR体系污染。

B.3.3  PCR反应体系配制及扩增

每个样品初筛需配置12个PCR扩增反应体系,对应检测12个目标基因,具体操作如下:

B.3.3.1 使用TE溶液(pH8.0)将合成的引物干粉稀释成100 µmol/L储存液。

B.3.3.2 根据表B.1中每种目标基因对应PCR体系内引物的终浓度,使用灭菌去离子水配制12种目标基因扩增所需的10×引物工作液(以uidA基因为例,如表B.2)。

表B.1 五种致泻大肠埃希氏菌目标基因引物序列及每个PCR体系内的终浓度

引物名称

引物序列c

终浓度nµmol/L

PCR产物长度(bp)

uidA–F

5′-ATG CCA GTC CAG CGT TTT TGC-3′

0.2

1487

uidA–R

5′-AAA GTG TGG GTC AAT AAT CAG GAA GTG-3′

0.2

escV–F

5′-ATT CTG GCT CTC TTC TTC TTT ATG GCT G-3′

0.4

544

escV–R

5′-CGT CCC CTT TTA CAA ACT TCA TCG C-3′

0.4

eae-Fa

5′-ATT ACC ATC CAC ACA GAC GGT-3′

0.2

397

eae-Ra

5′-ACA GCG TGG TTG GAT CAA CCT-3′

0.2

bfpB–F

5′-GAC ACC TCA TTG CTG AAG TCG-3′

0.1

910

bfpB–R

5′-CCA GAA CAC CTC CGT TAT GC-3′

0.1

stx1–F

5′-CGA TGT TAC GGT TTG TTA CTG TGA CAG C-3′

0.2

244

stx1–R

5′-AAT GCC ACG CTT CCC AGA ATT G-3′

0.2

stx2–F

5′-GTT TTG ACC ATC TTC GTC TGA TTA TTG AG-3′

0.4

324

stx2–R

5′-AGC GTA AGG CTT CTG CTG TGA C-3′

0.4

lt–F

5′-GAA CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT G-3′

0.1

655

lt–R

5′-CTT TCA ATG GCT TTT TTT TGG GAG TC-3′

0.1

stp–F

5′-CCT CTT TTA GYC AGA CAR CTG AAT CAS TTG-3′

0.4

157

stp–R

5′-CAG GCA GGA TTA CAA CAA AGT TCA CAG-3′

0.4

sth–F

5′-TGT CTT TTT CAC CTT TCG CTC-3′

0.2

171

sth–R

5′-CGG TAC AAG CAG GAT TAC AAC AC-3′

0.2

invE–F

5′-CGA TAG ATG GCG AGA AAT TAT ATC CCG-3′

0.2

766

invE–R

5′-CGA TCA AGA ATC CCT AAC AGA AGA ATC AC-3′

0.2

 ipaH-Fb

5′-TTG ACC GCC TTT CCG ATA CC-3′

0.1

647

 ipaH-Rb

5′-ATC CGC ATC ACC GCT CAG AC-3′

0.1

aggR–F

5′-ACG CAG AGT TGC CTG ATA AAG-3′

0.2

400

aggR–R

5′-AAT ACA GAA TCG TCA GCA TCA GC-3′

0.2

pic–F

5′-AGC CGT TTC CGC AGA AGC C-3′

0.2

1111

pic–R

5′-AAA TGT CAG TGA ACC GAC GAT TGG-3′

0.2

astA–F

5′-TGC CAT CAA CAC AGT ATA TCC G-3′

0.4

102

astA–R

5′-ACG GCT TTG TAG TCC TTC CAT-3′

0.4

16S rDNA-F

5′-GGA GGC AGC AGT GGG AAT A-3

0.25

1062

16S rDNA-R

5-TGA CGG GCG GTG TGT ACA AG-3

0.25

  注: aescVeae基因选作其中一个;binvEipaH基因选作其中一个;c表中不同基因的引物序列可采用可靠性验证的其他序列代替。

表B.2 每种目标基因扩增所需10×引物工作液配制表

引物名称

体积(µL)

100 µmol/L uidA–F

10×n

100 µmol/L uidA–R

10×n

灭菌去离子水

100 - 2×(10×n)

总体积

100

注: n:每条引物在反应体系内的终浓度(详见表B.1)。

B.3.3.3  将10×引物工作液、10×PCR反应缓冲液、25 mmol/L MgCl22.5 mmol/L dNTPs、灭菌去离子水从-20℃冰箱中取出,融化并平衡至室温,使用前混匀;5 U/µL Taq酶在加样前从-20℃冰箱中取出。

B.3.3.4  每个样品按照表B.3的加液量配制12个25 µL反应体系,分别使用12种目标基因对应10×引物工作液。

   表B.3 五种致泻大肠埃希氏菌目标基因扩增体系配制表

试剂名称

加样体积(µL)

灭菌去离子水

12.1

10×PCR 反应缓冲液

2.5

25 mmol/L MgCl2

2.5

2.5 mmol/L dNTPs

3.0

10×引物工作液

2.5

5 U/µL Taq酶

0.4

DNA模板

2.0

总体积

25

B.3.3.5  按照如下反应条件设置PCR仪:预变性94  5 min变性94  30 s,复性63  30 s,延伸72  1.5 min,30个循环最后72 延伸5 min

B.3.3.6  将配制完成的PCR反应管放入PCR仪中,核查PCR反应条件正确后,启动反应程序。

B.3.4琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物

B.3.4.1  称量4 g琼脂糖粉,加入至200 mL的1×TAE电泳缓冲液中,充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾,直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。

B.3.4.2  待琼脂糖溶液冷却至60 ℃左右时,加入溴化乙锭(EB)至终浓度为0.5 µg/mL,充分混匀后,轻轻倒入已放置好梳子的模具中,凝胶的长度要大于10 cm,适宜厚度为3 mm~5 mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡,用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。

B.3.4.3  当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后,轻轻拔出梳子,小心将胶块和胶床放入电泳槽中,样品孔在阴极端。

B.3.4.4 向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液,液面高于胶面1 mm~2 mm 。

B.3.4.5 将5 µL PCR产物与1 µL 6×上样缓冲液混匀后,用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔中,小心上样于孔中;阳性对照的PCR反应产物加入到最后一个泳道;第一个泳道中加入2 µL分子量Marker 。

B.3.4.6  接通电泳仪电源,根据公式:电压=电泳槽正负极间的距离(cm)×5 V/cm计算并设定电泳仪电压数值;启动电压开关,电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。

B.3.4.7  电泳30 min~45 min后,切断电源。取出凝胶放入凝胶成像系统或紫外成像仪中观察结果,拍照并记录数据。

B.3.5 结果判定

B.3.5.1   电泳结果中空白对照无条带出现,阴性对照仅有uidA条带扩增,阳性对照中出现所有目标条带,PCR检测结果成立。

B.3.5.2   根据电泳图中目标条带大小,判断目标条带的种类,记录每个泳道中目标条带的种类。

B.3.5.3   在表B.4中查找不同目标条带种类及组合所对应的致泻大肠埃希氏菌类别。

表B.5 五种致泻大肠埃希氏菌目标条带与型别对照表

致病型别

目标条带的种类组合

EAEC

aggR(+)

uidAc+/-)

EPEC

bfpB+/-), escVa+, stx1-, stx2-

STEC/EHEC

escV a(+/-, stx1+, stx2-, bfpB-

escV a(+/-stx1-, stx2+, bfpB-

escV a(+/-, stx1+, stx2+, bfpB-

ETEC

lt, stp, sth中一条或一条以上阳性

EIEC

invEb+

注:a:在判定EPEC或SETC/EHEC时,escV与eae基因等同效果;b:在判定EIEC时,invE与iapH基因等同效果。c:uidA+:97%以上大肠埃希氏菌为阳性。

 

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