1 范围
本标准规定了食品中肉毒梭菌（Clostridium botulinum）及肉毒毒素（botulinum Toxin）的检验方法。
本标准适用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a）冰箱：2℃～5℃、-20℃;
b）天平：感量0.1g;
c）无菌手术剪、镊子、试剂勺；
d）均质器或无菌乳钵；
e）离心机：3000 rpm、14000 rpm
f）厌氧培养装置；
g）恒温培养箱：35℃±1℃、28℃±1℃；
h）恒温水浴箱：37℃±1℃、60℃±1℃、80℃±1℃；
i）显微镜：10倍×100倍
j）PCR仪；
k）电泳仪或毛细管电泳仪；
l）凝胶成像系统或紫外检测仪；
m）核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；
n）可调微量移液器：0.2µL～2µL、2µL～20µL、20µL～200µL、100µL～1000µL；
o）无菌吸管：1.0mL、10.0 mL、25 .0mL；
p）无菌锥形瓶：100 mL；
q）培养皿：直径90mm；
r）离心管：50mL、1.5mL；
s）PCR反应管；
t）无菌注射器：1.0mL；
u）小鼠：15g～20g，每一批次试验应使用同一品系的KM或ICR小鼠。
3 培养基和试剂
除另有规定外，PCR试验所用试剂为分析纯或符合生化试剂标准，水应符合GB/T6682中一级水的规格。
3.1 庖肉培养基：见附录A中A.1。
3.2 胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤（TPGYT）：见附录A中A.2。
3.3 卵黄琼脂培养基：见附录A中A.3。
3.4 明胶磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。
3.5 革兰氏染色液：见附录A中A.5。
3.6 10%胰蛋白酶溶液：见附录A中A.6。
3.7 磷酸盐缓冲液（PBS）：见附录A中A.7。
3.8 1mol/L氢氧化钠。
3.9 1mol/L盐酸。
3.10 肉毒毒素诊断血清。
3.11 无水乙醇和95%乙醇。
3.12 10mg/mL溶菌酶溶液。
3.13 10mg/mL蛋白酶K溶液。
3.14 3mol/L 乙酸钠溶液（pH5.2）。
3.15 TE缓冲液。
3.16 引物：根据表1中序列合成，临用时用超纯水配制引物浓度为10 µmol/L。
3.17 10×PCR缓冲液。
3.18 25mmol/LMgCl2。
3.19 dNTPs：dATP、dTTP、dCTP、dGCP。
3.20 Taq酶。
3.21 琼脂糖：电泳级。
3.22 溴化乙锭或Goldview。
3.23 5×TBE缓冲液。
3.24 6×加样缓冲液。
3.25 DNA分子量标准。
4 检验程序
肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序见图1。
5 操作步骤
5.1 样品制备5.1.1 样品保存
待检样品（除未打开的正常罐头食品）和明显膨胀的罐头食品应放2℃～5℃冰箱冷藏，直至检验。
5.1.2 固态食品
固体或游离液体很少的半固态食品，以无菌操作称取样品25g，放入无菌均质袋或无菌乳钵，块状食品用无菌刀剪切碎，含水量较高的固态食品加入25mL明胶磷酸盐缓冲液，乳粉、牛肉干等含水量低的食品加入50mL明胶磷酸盐缓冲液，浸泡30分钟，用拍击式均质器拍打2min或用无菌研杵研磨制备样品匀液，收集备用。
5.1.3 液态食品
液态食品摇匀，直接量取25mL检验。
5.1.4 样品处理
取样后的剩余样品放2℃～5℃冰箱冷藏，直至检验结果报告发出后，按感染性废弃物要求进行无害化处理，检出阳性的样品应采用压力蒸汽灭菌方式进行无害化处理。
5.2 肉毒毒素检测
5.2.1 毒素液制备
取样品匀液约40mL或均匀液体样品25mL放入离心管，3000r/min，10min～20min离心，收集上清液分为两份放入无菌试管中，一份直接用于毒素检测，一份用于胰酶处理后进行毒素检测，液体样品保留底部沉淀液约12mL备用。
胰酶处理：用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节上清液pH至6.2，按9份上清液加1份10%胰酶（活力1:250）水溶液，混匀，37℃孵育60min，期间间或轻轻摇动反应液。
5.2.2 检出试验
用5号针头注射器取离心上清液和胰酶处理上清液分别腹腔注射小鼠三只，每只0.5mL，观察和记录小鼠48h中毒表现。小鼠在24h内出现肉毒毒素中毒典型症状，多数在6h内发病和死亡，其主要表现为竖毛、呼吸困难、四肢瘫软，呈现风箱式呼吸、腰腹部凹陷、宛如蜂腰，因呼吸衰竭而死亡，可初步判定为毒素检出。若小鼠在24h后发病或死亡，应仔细观察小鼠症状，必要时浓缩上清液重复试验，以排除肉毒毒素中毒。若小鼠出现猝死（30min内）导致症状不明显时，可将毒素上清液进行适当稀释，重复试验。
注：毒素检测动物试验应遵循《食品毒理学实验室操作规范》（GB15193.2）的规定。
5.2.3 确证试验
上清液或（和）胰酶处理上清液的毒素检出试验阳性者，取相应试验液三份，每份0.5mL，其中第一份加等量多型混合肉毒毒素诊断血清，混匀，37℃孵育30min；第二份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min；第三份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀。将三份混合液分别腹腔注射小鼠各两只，每只0.5mL，观察96h。
结果判定：若注射第一份和第二份混合液的小鼠未死亡，而第三份混合液小鼠发病死亡，并出现肉毒毒素中毒的特有症状，则判定检测样品中检出肉毒毒素。
5.2.4 毒力测定（选做项目）
取确证试验阳性的试验液，用明胶磷酸盐缓冲液稀释制备一定倍数稀释液，如10倍、50倍、100倍、500倍等，分别腹腔注射小鼠各两只，每只0.5mL，观察和记录小鼠发病与死亡情况至96h，计算最低致死剂量MLD/mL或MLD/g，评估样品中肉毒毒素毒力，MLD等于小鼠全部死亡的最高稀释倍数乘以样品试验液稀释倍数。例如，样品稀释两倍制备的上清液，再稀释100倍试验液使小鼠全部死亡，而500倍稀释液组存活，则该样品毒力为200MLD/g。
5.2.5 定型试验（选做项目）
根据毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将上清液稀释至10～1000MLD/mL作为定型试验液，分别与各单型肉毒毒素诊断血清等量混合（国产诊断血清一般为冻干血清，用1mL生理盐水溶解，能中和10000LD50的相应毒素），37℃孵育30min，分别腹腔注射小鼠两只，每只0.5mL，观察和记录小鼠发病与死亡情况至96h。同时，用明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与试验液等量混合作为小鼠试验对照。
结果判定：某一单型诊断血清组动物未发病且正常存活，而对照组和其他单型诊断血清组动物发病死亡，则判定样品中所含肉毒毒素为该型肉毒毒素。
注：未经胰酶激活处理的样品上清液的毒素检出试验或确证试验为阳性者，则毒力测定和定型试验可省略胰酶激活处理试验。
5.3 肉毒梭菌检验
5.3.1 增菌培养与检出试验
5.3.1.1 取出庖肉培养基4支和TPGY肉汤管2支，隔水煮沸10min-15min，排除溶解氧，迅速冷却，切勿摇动，在TPGY肉汤管中缓慢加入胰酶液至液体石蜡液面下肉汤中，每支1mL，制备成TPGYT。
5.3.1.2 吸取样品匀液或毒素制备过程中的离心沉淀液2mL接种至庖肉培养基中，每份样品接种4支，2支直接放置35℃±1℃厌氧培养至5d，另2支放80℃保温10min，再放置35℃±1℃厌氧培养至5d；同样方法接种2支 TPGYT肉汤管， 28℃±1℃厌氧培养至5d。接种时将样品液吸管慢慢穿过肉汤液面接种到肉汤管底部，切勿搅动。
5.3.1.3 检查记录增菌培养物的浊度、产气、肉渣颗粒消化情况，并注意气味。肉毒梭菌培养物为产气、肉汤浑浊（庖肉培养基中A型和B型肉毒梭菌肉汤变黑）、消化或不消化肉粒、有异臭味。
5.3.1.4 将增菌培养物进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态，注意是否有芽胞、芽胞的相对比例、芽胞在细胞内的位置。
5.3.1.5 若增菌培养物5d无菌生长,应延长培养至10d，观察生长情况。
5.3.1.6 取增菌培养物阳性管的上清液，按5.2方法进行毒素检出和确证试验，必要时进行定型试验，阳性结果可证明样品中有肉毒梭菌存在。
注：TPGYT增菌液的毒素试验无需添加胰酶处理。
5.3.2 分离与纯化培养
5.3.2.1 增菌液前处理，吸取1mL增菌液至无菌螺旋帽试管中，加入等体积过滤除菌的无水乙醇，混匀，在室温下放置1h。
5.3.2.2 取增菌培养物和经乙醇处理的增菌液分别划线接种至卵黄琼脂平板，35℃±1℃厌氧培养48h。
5.3.2.3 观察平板培养物菌落形态，肉毒梭菌菌落隆起或扁平、光滑或粗糙，易成蔓延生长，边缘不规则，在菌落周围形成乳色沉淀晕圈（E型较宽，AB型较窄），用斜视光观察，菌落表面呈现珍珠样彩虹，这种光泽区可随蔓延生长扩散到不规则边缘区外的晕圈。
5.3.2.4 菌株纯化培养，在分离培养平板上选择5个肉毒梭菌可疑菌落，分别接种卵黄琼脂平板，35℃±1℃，厌氧培养48h，按5.3.2.3观察菌落形态及其纯度。
5.3.3 鉴定试验
5.3.3.1 染色镜检
挑取可疑菌落进行涂片、革兰氏染色和镜检，肉毒梭菌菌体形态为革兰氏阳性粗大杆菌、芽胞卵圆形、大于菌体、位于次端，菌体呈网球拍状。
5.3.3.2 毒素基因检测（PCR快速鉴定）
a）菌株活化：挑取可疑菌落或待鉴定菌株接种TPGY，35℃±1℃厌氧培养24h。
b）DNA模板制备：吸取TPGY培养液1.4mL至无菌离心管中， 14000g离心２min，弃上清，加入1.0mLPBS悬浮菌体，14000g离心２min，弃上清，用400µL PBS重悬沉淀，加入10mg/mL溶菌酶溶液100µL，摇匀，37℃水浴15min，加入10mg/mL蛋白酶K溶液10µL，摇匀，60℃水浴1h，再沸水浴10min，14000g离心２min，上清液转移至无菌小离心管中，加入3mol/LNaAc溶液50µL和95%乙醇1.0mL，摇匀，-70℃或-20℃放置30min，14000g离心10min，弃去上清液，沉淀干燥后溶于200µLTE缓冲液，置于-20°C保存备用。
注：根据实验室实际情况，也可采用常规水煮沸法或商品化试剂盒制备DNA模板。
c）核酸浓度测定（必要时）：取5µLDNA模板溶液，加超纯水稀释至1mL，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm波段的吸光值A260和A280。按式（1）计算DNA浓度。当浓度在0.34µg/mL～340µg/mL或A260/A280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。
C= A260×N×50 ………………………(1)
式中：
C—DNA浓度，单位为µg/mL；
A260—260nm处的吸光值；
N—核酸稀释倍数。
d）PCR扩增
1）采用分别针对Ａ型、Ｂ型、Ｅ型和Ｆ型肉毒梭菌毒素基因设计的特异性引物（见表1）进行PCR扩增，每个PCR反应管检测一种型别的肉毒梭菌。
2）反应体系配制见表2，反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行相应调整。
3）反应程序，预变性95℃、５min；循环参数94℃、１min，60℃、１min，72℃、１min；循环数40；后延伸72℃，10min；4℃保存备用。
4）PCR扩增体系应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。用含有已知肉毒梭菌菌株或含肉毒毒素基因的质控品作阳性对照、非肉毒梭菌基因组DNA作阴性对照、无菌水作空白对照。
e）凝胶电泳检测PCR扩增产物，用0.5×TBE缓冲液配制1.2～1.5的琼脂糖凝胶，凝胶加热融化后冷却至60℃左右加入溴化乙锭至0.5µg/mL或Goldview5µL/100mL制备胶块，取10µLPCR扩增产物与2.0µL6×加样缓冲液混合，点样，其中一孔加入DNA分子量标准。0.5×TBE电泳缓冲液，10V/cm恒压电泳，根据溴酚蓝的移动位置确定电泳时间，用紫外检测仪或凝胶成像系统观察和记录结果。
PCR扩增产物也可采用毛细管电泳仪进行检测。
f）结果判定，阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带（表1），判定本次PCR检测成立；待测样品出现预期大小的扩增条带，判定为PCR结果阳性，根据表1判定肉毒梭菌菌株型别，待测样品未出现预期大小的扩增条带，判定PCR结果为阴性。
5.3.3.3 菌株产毒试验
将PCR阳性菌株或可疑肉毒梭菌菌株接种庖肉培养基或TPGYT肉汤（用于E型肉毒梭菌），按5.3.1.2条件厌氧培养5d，按5.2方法进行毒素检测和（或）定型试验，毒素确证试验阳性者，判定为肉毒梭菌，根据定型试验结果判定肉毒梭菌型别。
注：根据PCR阳性菌株型别，可直接用相应型别的肉毒毒素诊断血清进行确证试验。
6 结果报告
6.1 肉毒毒素检测结果报告
根据5.2.3确证试验结果，报告25g(mL)样品中检出或未检出肉毒毒素。
根据5.2.5定型试验结果，报告25g(mL)样品中检出某型肉毒毒素。
6.2 肉毒梭菌检验结果报告
根据5.3.3.2 PCR检测结果阴性，报告样品中未检出肉毒梭菌。
根据5.3.3.3菌株产毒试验结果，报告样品中检出肉毒梭菌或某型肉毒梭菌或未检出肉毒梭菌。
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