乳酸菌检验（征求意见稿）

1  范围

本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的检验方法。

本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。

2  规范性引用文件

本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。

3  术语和定义

3.1  乳酸菌 lactic acid bacteria

    一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和链球菌属（Streptococcus）。

4  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

4.1  恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。

4.2  冰箱：2 ℃～5 ℃。

4.3  均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。

4.4  天平：感量0.1 g。

4.5  无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。

4.6  无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。

4.7  无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。

5  培养基和试剂

5.1  MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS培养基：见附录A中A.1。

5.2  MC培养基（Modified Chalmers 培养基）：见附录A中A.2。

5.3  0.5%蔗糖发酵管:见附录A中A.3。

5.4  0.5%纤维二糖发酵管:见附录A中A.3。

5.5  0.5%麦芽糖发酵管:见附录A中A.3。

5.6  0.5%甘露醇发酵管:见附录A中A.3。

5.7  0.5%水杨苷发酵管:见附录A中A.3。

5.8  0.5%山梨醇发酵管:见附录A中A.3。

5.9  0.5%乳糖发酵管:见附录A中A.3。

5.10 七叶苷发酵管:见附录A中A.4

5.11 革兰氏染色液：见附录A中A.5。

5.12 莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）：化学纯。

5.13 半胱氨酸盐酸盐（Cysteine Hydrochloride）：纯度＞99%。

6  检验程序

乳酸菌检验程序见图1。

7  操作步骤

7.1样品制备

7.1.1  样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

7.1.2  冷冻样品可先使其在2 ℃～5 ℃条件下解冻，时间不超过18 h，也可在温度不超过45 ℃的条件解冻，时间不超过15 min。

7.1.3  固体和半固体食品：以无菌操作称取25 g样品，置于装有225 mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，制成1:10样品匀液；或置于225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min制成1:10的样品匀液。

7.1.4  液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25 mL放入装有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。

7.2  步骤

7.2.1  用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

7.2.2  另取1 mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1 mL灭菌吸管或吸头。

7.2.3  乳酸菌计数

7.2.3.1  乳酸菌总数

根据待检样品活菌总数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至50℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃厌氧培养48 h±2 h，培养后计数。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。

7.2.3.2  双歧杆菌计数

    根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至50℃的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均。36℃±1℃厌氧培养48 h±2 h，培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成。

7.2.3.3  嗜热链球菌计数

根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至50℃的MC培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃需氧培养48 h±2 h，培养后计数。嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2 mm±1 mm， 菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成。

7.2.3.4  乳杆菌计数

    7.2.3.1 项乳酸菌总数结果减去7.2.3.2 项双歧杆菌与7.2.3.3 项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。

7.3  菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。

7.3.1  选取菌落数在30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

7.3.2  其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

7.3.3  当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

7.4  结果的表述

7.4.1  若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。

7.4.2  若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：

式中：

N——样品中菌落数；

∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n₁——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n₂——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

7.4.3  若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

7.4.4  若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7.4.5  若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

7.4.6  若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7.5  菌落数的报告

7.5.1  菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

7.5.2  菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

7.5.3  称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

8  结果与报告

根据菌落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g（mL）表示。

9  乳酸菌的鉴定（可选做）

9.1  纯培养

挑取3个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，乳杆菌属接种于MRS琼脂平板，置36 ℃±1 ℃厌氧培养48 h。

9.2  鉴定

9.2.1  双歧杆菌的鉴定按GB 4789.34的规定操作。

9.2.2  涂片镜检：乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞，革兰氏染色阳性。嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0.5 μm～2.0 μm，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。

9.2.3  乳酸菌菌种主要生化反应见表1和表2。

附  录 A  

培养基及试剂

A.1  MRS培养基

A.1.1  成分

A.1.2  制法

将上述成分加入到1 000 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。

A.1.3  莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS培养基

A.1.3.1  莫匹罗星锂盐储备液制备：称取50mg莫匹罗星锂盐加入到50 mL蒸馏水中，用0.22 mm微孔滤膜过滤除菌。

A.1.3.2  半胱氨酸盐酸盐储备液制备：称取250mg莫匹罗星锂盐加入到50 mL蒸馏水中，用0.22 mm微孔滤膜过滤除菌。

A.1.3.2  制法

将A.1.1 成分加入到950 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。临用时加热熔化琼脂，在水浴中冷至48 ℃，用带有0.22 mm微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐储备液及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中，使培养基中莫匹罗星锂盐的浓度为50 mg/mL，半胱氨酸盐酸盐的浓度为500 mg/mL。

A.2  MC培养基

A.2.1  成分

A.2.2  制法

将前面7种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节pH，加入中性红溶液。分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。

A.3  乳酸杆菌糖发酵管

A.3.1  基础成分

A.3.2  制法

按0.5%加入所需糖类，并分装小试管,121 ℃高压灭菌15 min～20 min。

A.4七叶苷培养基

A.5革兰氏染色液

A.5.1  结晶紫染色液

A.5.1.1  成分

A.5.1.2  制法

将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

A.5.2  革兰氏碘液

A.5.2.1  成分

A.5.2.2  制法

将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。

A.5.3  沙黄复染液

A.5.3.1  成分

A.5.3.2  制法

将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

A.5.4  染色法

A.5.4.1 将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗。

A.5.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。

A.5.4.3 滴加95％乙醇脱色，约15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。

A.5.4.4 滴加复染液，复染1 min。水洗、待干、镜检。

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