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双歧杆菌检验(征求意见稿)



录入时间:2016-4-13 16:14:17 来源:青岛海博生物

1  范围

本标准规定了食品用双歧杆菌(Bifidobacterium)的鉴定及计数方法。

本标准适用于食品双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数本标准适用于食品中仅含有单一的双歧杆菌菌种的鉴定;以及食品中仅含有双歧杆菌属的计数,双歧杆菌属可包含一种或多种不同的双歧杆菌菌种

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

2.1  恒温培养箱:36 ±1

2.2  冰箱:2 5

2.3  天平:感量0.1 g

2.4  无菌试管:18 mm×180 mm15 mm×100 mm

2.5  无菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)或微量移液器及配套吸头。

2.6  无菌培养皿:直径90 mm

3  培养基和试剂

3.1  双歧杆菌培养基:见附录A.1

3.2  PYG培养基:见附录A.2

3.3  甲醇分析纯。

3.4  三氯甲烷:分析纯。

3.5  冰乙酸:分析纯。

3.6  乳酸:分析纯。

3.7  乙酸标准溶液吸取分析纯冰乙酸5.7 mL移入100 mL容量瓶中加水至刻度标定方法见附录B.1此溶液浓度约为1 mol/L

3.8  乳酸标准溶液吸取分析纯乳酸8.4 mL移入100 mL容量瓶中加水至刻度标定方法见附录B.1,此溶液浓度约为1 mol/L


4  检验程序

双歧杆菌的检验程序见图1

1  双歧杆菌的检验程序

5  操作步骤

5.1  无菌要求:全部操作均应遵循无菌操作程序。

5.2  食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数

5.2.1  鉴定

5.2.1.1  接种:半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板。真空冷冻干燥菌种,先加适量灭菌生理盐水,溶解菌粉,然后接种在双歧杆菌琼脂平板。平板在36 ±1 厌氧培养48 h±2 h

5.2.1.2  涂片镜检:双歧杆菌为革兰氏染色阳性,不抗酸、无芽孢无动力,菌体形态多样,呈短杆状、纤细杆状或球形,可形成各种分支或分叉形态。

5.2.1.3  生化鉴定:挑取5.2.1.1步骤中的平板上生长的单个菌落,进行生化反应检测。双歧杆菌的过氧化氢酶试验为阴性。不同双歧杆菌菌种主要生化反应见表1

5.2.1.4  气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物(可选项),见附录B.1

5.2.2  计数

5.2.2.1  样品的稀释

5.2.2.2.1  1.0 g固体菌种9.0 mL生理盐水或其它稀释液,制成1:10的样品匀液。

5.2.2.2.2  1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0 mL,沿管壁缓慢注于装有9.0 mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。

5.2.2.2.3  另取1 mL无菌吸管或吸头,按5.2.2.2.1操作程序制备10系列稀释样品匀液每递增稀释一次,即换用11 mL灭菌吸管或吸头。

5.2.2.2.4  根据对样品双歧杆菌浓度的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液在进行10倍递增稀释时,吸取1.0 mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1.0 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

5.2.2.2.5  及时将 15 mL20 mL冷却至 46 双歧杆菌琼脂培养基(可放置于46 ±1 恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。

5.2.2.2  培养

待琼脂凝固后,将平板翻转,36 ±1 厌氧培养48 h±2 h

5.2.2.3  菌落计数

可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落

形成单位(colony-forming unitsCFU)表示。

5.2.2.3.1  选取菌落数在30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数,大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

5.2.2.3.2  其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。

5.2.2.3.3  当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。

5.3  食品中双歧杆菌的鉴定及计数

5.3.1  鉴定

5.3.1.1  称重取样25.0 g,或体积取样25.0 mL,置于装有225 mL稀释液的灭菌锥形瓶内,制成1:10的样品匀液。

5.3.1.2  上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板。平板在36 ℃±1 厌氧培养48 h±2 h

5.3.1.3  纯培养

挑取3个或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板。平板在36 ±1 厌氧培养48 h±2 h

5.3.1.4  涂片镜检:参照5.2.1.2

5.3.1.5  生化鉴定:参照5.2.1.3

5.3.1.6  气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物参照5.2.1.4

5.3.2  计数

5.3.2.1  5.3.1.1步。

5.3.2.2  稀释步骤  参照5.2.2.1

5.3.2.3  菌落计数  参照5.2.2.3

6  报告

6.1  鉴定

根据5.2.1.2项镜检5.2.1.3项生化鉴定报告双歧杆菌属的种名根据5.2.1.4乙酸与乳酸微摩尔之比报告双歧杆菌有机酸代谢产物

6.2  计数

6.2.1  菌落计数的计算方法和报告:参照GB 4789.2《食品微生物学检验 菌落总数测定》中的7.17.2

6.2.2  称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。

 

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