GBT 4789.41-2016 肠杆菌科检验

１　范围
本标准规定了食品中肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的检验方法。
本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数；第二法适用于肠杆菌科含量较低食品中肠杆菌科的计数。
２ 术语和定义
２.１
肠杆菌科　
在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
２.２
肠杆菌科计数　
按本标准规定方法，对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。
２.３
最可能数　
基于泊松分布的一种间接计数方法。
３ 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
３．１　恒温培养箱：３６ ℃±１ ℃。
３．２　冰箱：２ ℃～５ ℃。
３．３　水浴箱：４６ ℃±１ ℃。
３．４　天平：感量０．１ｇ。
３．５　显微镜：１０倍～１００倍。
３．６　均质器。
３．７　振荡器。
３．８　无菌吸管：１ｍＬ（具０．０１ｍＬ 刻度）、１０ｍＬ（具０．１ｍＬ 刻度）或微量移液器及吸头。
３．９　无菌锥形瓶或等效容器：容量１５０ｍＬ、５００ｍＬ。
３．１０　无菌培养皿：直径９０ｍｍ。
３．１１　无菌试管：１８ｍｍ×１８０ｍｍ、１５ｍｍ×１５０ｍｍ。
３．１２　ｐＨ 计或ｐＨ 比色管或精密ｐＨ 试纸。
４　培养基和试剂
４．１　缓冲蛋白胨水（ＢＰＷ）：见Ｂ．１。
４．２　缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤（ＥＥ 肉汤）：见Ｂ．２。
４．３　结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（ＶＲＢＧＡ）：见Ｂ．３。
４．４　营养琼脂（ＮＡ）：见Ｂ．４。
４．５　葡萄糖琼脂：见Ｂ．５。
４．６　革兰氏染色液：见Ｂ．６。
４．７　氧化酶试剂：见Ｂ．７。
４．８　无菌１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ：见Ｂ．８。
４．９　无菌１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ：见Ｂ．９。
第一法　肠杆菌科平板计数法
５　检验程序
肠杆菌科平板计数法检验程序见图１。

６　操作步骤
６．１　样品的稀释
６．１．１　固体和半固体样品：称取２５ｇ 样品放入盛有２２５ ｍＬＢＰＷ 的无菌均质杯中，８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或放入盛有２２５ ｍＬ ＢＰＷ 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，制成１∶１０的样品匀液。
６．１．２　液体样品：以无菌吸管吸取２５ｍＬ 样品放入盛有２２５ｍＬＢＰＷ 的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成１∶１０的样品匀液。
６．１．３　用１ｍＬ 无菌吸管或微量移液器吸取１∶１０样品匀液１ｍＬ，沿管壁缓缓注入盛有９ｍＬＢＰＷ 的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面），振摇试管或换用１支１ ｍＬ 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成１∶１００的样品匀液。
６．１．４　按６．１．３操作程序，依次制成１０倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释１次，换用１支１ｍＬ 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过１５ｍｉｎ。
６．２　倾注平板和培养
６．２．１　根据对样品污染状况的估计及相关限量要求，选择２个～３个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种２个无菌平皿。同时，分别吸取１ｍＬＢＰＷ 加入两个无菌平皿内作为空白对照。
６．２．２　将１０ｍＬ～１５ｍＬ 冷却至４６ ℃的ＶＲＢＧＡ（可放置于４６ ℃±１ ℃恒温水浴箱中保温）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，使样品匀液与培养基充分混匀。
６．２．３　待琼脂凝固后，倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层。防止蔓延生长并使菌落特征更为
明显。
６．２．４　待ＶＲＢＧＡ 平板上层琼脂凝固后翻转平板，３６ ℃±１ ℃培养１８ｈ～２４ｈ。
６．３　典型菌落计数和确认
６．３．１　肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在１５ＣＦＵ～１５０ＣＦＵ 之间、无蔓延菌落生长的平板，只计数典型菌落数。菌落计数以菌落形成单位（ＣＦＵ）表示。
６．３．２　其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释
度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以２，代表一个平板菌落数。
６．３．３　当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
６．３．４　从每个平板上至少挑取５个（小于５个全选）典型菌落进行确认；如果有不同形态的典型菌落，则每种形态分别至少挑取１个菌落进行确认。
６．３．５　典型菌落的确认：
ａ）　分别将所挑选的每一个菌落，划线于营养琼脂平板，３６ ℃±１ ℃培养１８ｈ～２４ｈ，挑取平板上的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。
ｂ）　革兰氏染色镜检：肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，大小为（０．３～１．０）μｍ× （１．０～６．０）μｍ。
ｃ）　氧化酶试验：用铂／铱接种环或玻璃棒（不要用镍铬接种环）挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂的滤纸上，滤纸的颜色在１０ｓ内变成蓝紫色，判为阳性反应。
ｄ）　葡萄糖发酵试验：用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌落，穿刺于葡萄糖琼脂内，于３６ ℃±
１ ℃培养２４ｈ±２ｈ，若试管内的内容物变为黄色，判为阳性反应。
６．４　结果的计算
６．４．１　一般原则
若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内，按式（１）计算，示例见Ａ．１、Ａ．２、Ａ．３、Ａ．４。

　式中：
N———样品中肠杆菌科菌落数；
Σa———确证的肠杆菌科菌落数之和；
n1 ———第一稀释度（低稀释倍数）平板个数（含确证的肠杆菌科菌落）；
n2 ———第二稀释度（高稀释倍数）平板个数（含确证的肠杆菌科菌落）；
d———稀释因子（第一稀释度）。
其中，a按式（２）计算：

　式中：
a———确证的肠杆菌科菌落数；
b———某一平板中犃个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数，b≤A；
A———某一平板中用于确认试验的菌落数；
C———某一平板中典型菌落总数。
６．４．２　低菌落数
若最低稀释度（包括液体样品原液）平板的典型菌落数均小于１５ＣＦＵ，具有确证的肠杆菌科菌落，
则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。
若最低稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，或典型菌落数均小于１５ＣＦＵ，且无确证的
肠杆菌科菌落，则以小于１乘以最低稀释倍数计算。
６．４．３　特殊情况
第一稀释度平板上的典型菌落数均大于１５０ＣＦＵ，且有确证的肠杆菌科菌落，以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在１５ＣＦＵ～１５０ＣＦＵ 之间，则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算，示例见Ａ．５。
若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内，且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于１乘以最低稀释倍数计算。
７　报告
７．１　菌落数小于１００时，以整数报告。
７．２　菌落数大于或等于１００时，对第３位数字进行修约后，取前２位数字，后面用０代替位数；也可用１０的指数形式来表示，采用两位有效数字。
７．３　数字修约按“四舍五入”原则进行。
７．４　若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
７．５　若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
７．６　称重取样以ＣＦＵ／ｇ为单位报告，体积取样以ＣＦＵ／ｍＬ 为单位报告。
第二法　肠杆菌科犕犘犖计数法
８　检验程序
肠杆菌科ＭＰＮ 计数法检验程序见图２。

９　操作步骤
９．１　样品的稀释
按６．１进行。
９．２　接种和培养
９．２．１　非选择性前增菌
根据对样品污染状况的估计及相关限量要求，选择３ 个适宜连续稀释度的样品匀液，每个稀释度３管，共９管ＢＰＷ 于３６ ℃ ±１ ℃培养１８ｈ±２ｈ。
９．２．２　选择性增菌
从ＢＰＷ 各培养管中，分别移取１ｍＬ 培养物，接种于１０ｍＬ 的ＥＥ 肉汤中，３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ。
９．２．３　分离
用接种环从ＥＥ 各肉汤管中分别取培养物１环，划线接种于ＶＲＢＧＡ 平板，３６ ℃±１ ℃培养２４ｈ±２ｈ，观察平板上有无典型菌落。
９．３　典型菌落的确认
典型菌落确认见６．３。
１０　报告
肠杆菌科为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性。只要有１个菌落确认为肠杆菌科，其所代表的ＥＥ 管即为肠杆菌科阳性，依据ＥＥ 阳性管数查ＭＰＮ 表（见附录Ｃ），报告每克（毫升）样品中肠杆菌科的ＭＰＮ 值。称重取样以ＭＰＮ／ｇ为单位报告，体积取样以ＭＰＮ／ｍＬ 为单位报告。

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