前 言
本标准代替GB4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。
1 范围
本标准规定了食品中菌落总数(Aerobicplatecount)的测定方法。
本标准适用于食品中菌落总数的测定。
2 术语和定义
菌落总数 aerobicplatecount
食品检样经过处理,在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后,所得每g(mL)检样中形成的微生物菌落总数。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3.1 恒温培养箱:36℃±1℃,30℃±1℃。
3.2 冰箱:2℃~5℃。
3.3 恒温水浴箱:46℃±1℃。
3.4 天平:感量为0.1g。
3.5 均质器。
3.6 振荡器。
3.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL 刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶:容量250mL、500mL。
3.9 无菌培养皿:直径90mm。
3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
3.11 放大镜或/和菌落计数器。
4 培养基和试剂
4.1 平板计数琼脂培养基:见A.1。
4.2 磷酸盐缓冲液:见A.2。
4.3 无菌生理盐水:见A.3。
5 检验程序
菌落总数的检验程序见图1。
6 操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000-10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。
6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。
6.1.3 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
6.1.4 按6.1.3操作,制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1 次1mL 无菌吸管或吸头。
6.1.5 根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释时,吸取1mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
6.1.6 及时将15mL~20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。
6.2 培养
6.2.1 待琼脂凝固后,将平板翻转,36℃±1培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。
6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4mL),凝固后翻转平板,按6.2.1条件进行培养。
6.3 菌落计数
6.3.1 可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。
6.3.2 选取菌落数在30CFU~300CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
6.3.3 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以
2,代表一个平板菌落数。
6.3.4 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
7 结果与报告
7.1 菌落总数的计算方法
7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)样品中菌落总数结果。
7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算:
N = ∑C/(n1 +0.1n2)d ……………………(1)
式中:
N ———样品中菌落数;
∑C———平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;
n1 ———第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;
n2 ———第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;
d ———稀释因子(第一稀释度)。
示例:
N = ∑C/(n1 +0.1n2)d = (232+244+33+35)/[2+ (0.1×2)]×10-2 = 544/0.022=24727
上述数据按7.2.2数字修约后,表示为25000或2.5×104。
7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.1.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU 之间,其中一部分小于30CFU 或大于300CFU 时,则以最接近30CFU 或300CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.2 菌落总数的报告
7.2.1 菌落数小于100CFU 时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。
7.2.2 菌落数大于或等于100CFU 时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。
7.2.4 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
7.2.5 称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 平板计数琼脂(platecountagar,PCA)培养基
A.1.1 成分
胰蛋白胨 5.0g
酵母浸膏 2.5g
葡萄糖 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
A.1.2 制法
将上述成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH 至7.0±0.2。分装试管或锥形瓶,121 ℃高压灭菌15min。
A.2 磷酸盐缓冲液
A.2.1 成分
磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g
蒸馏水 500mL
A.2.2 制法
贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH 至7.2,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1000 mL,分装于适宜容器中,121 ℃ 高压灭菌15min。
A.3 无菌生理盐水
A.3.1 成分
氯化钠 8.5g
蒸馏水 1000mL
A.3.2 制法
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
