前 言
本标准代替GB4789.30—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》。
本标准与GB4789.30—2010相比,主要变化如下:
———增加了“第二法 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法”;
———增加了“第三法 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法”;
———修改了范围。
1 范围
本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的检验方法。
本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验;第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数;第三法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低(<100CFU/g)而杂菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数,特别是牛奶、水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 冰箱:2℃~5℃。
2.2 恒温培养箱:30℃±1℃、36℃±1℃。
2.3 均质器。
2.4 显微镜:10x~100x。
2.5 电子天平:感量0.1g。
2.6 锥形瓶:100mL、500mL。
2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
2.8 无菌平皿:直径90mm。
2.9 无菌试管:16mm×160mm。
2.10 离心管:30mm×100mm。
2.11 无菌注射器:1mL。
2.12 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111或CMCC54004,或其他等效标准菌株。
2.13 英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090,或其他等效标准菌株。
2.14 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119,或其他等效标准菌株。
2.15 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967,或其他等效标准菌株。
2.16 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他产β-溶血环金葡菌,或其他等效标准菌株。
2.17 马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621,或其他等效标准菌株。
2.18 小白鼠:ICR体重18g~22g。
2.19 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE):见A.1。
3.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):见A.2。
3.3 李氏增菌肉汤LB(LB1,LB2):见A.3。
3.4 1%盐酸吖啶黄(acriflavineHCl)溶液:见A.3.2.1、A.3.2.2。
3.5 1%萘啶酮酸钠盐(naladixicacid)溶液:见A.3.2.1、A.3.2.2。
3.6 PALCAM 琼脂:见A.4。
3.7 革兰氏染液:见A.5。
3.8 SIM 动力培养基:见A.6。
3.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]:见A.7。
3.10 5%~8%羊血琼脂:见A.8。
3.11 糖发酵管:见A.9。
3.12 过氧化氢试剂:见A.10。
3.13 李斯特氏菌显色培养基。
3.14 生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统。
3.15 缓冲蛋白胨水:见A.11。
第一法 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验
4 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1。
5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取样品25g(mL)加入到含有225mLLB1 增菌液的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1min~2min;或放入盛225mLLB1 增菌液的均质杯中,以8000r/min~10000r/min均质1min~2min。于30℃±1℃培养24h±2h,移取0.1mL,转种于10mLLB2 增菌液内,于30 ℃±1℃ 培养24h±2h。
5.2 分离
取LB2 二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM 琼脂平板,于36 ℃±1 ℃培养24h~48h,观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色水解圈,有些菌落有黑色凹陷;在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征,参照产品说明进行判定。
5.3 初筛
自选择性琼脂平板上分别挑取3个~5个典型或可疑菌落,分别接种木糖、鼠李糖发酵管,于36℃±1℃ 培养24h±2h,同时在TSA-YE平板上划线,于36℃±1℃培养18h~24h,然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
5.4 鉴定(或选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等)
5.4.1 染色镜检:李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,大小为(0.4μm~0.5μm)×(0.5μm~2.0μm);用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察,该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
5.4.2 动力试验:挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或SIM 动力培养基,于25 ℃~30 ℃培养48h,李斯特氏菌有动力,在半固体或SIM 培养基上方呈伞状生长,如伞状生长不明显,可继续培养5d,再观察结果。
5.4.3 生化鉴定:挑取纯培养的单个可疑菌落,进行过氧化氢酶试验,过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。
5.4.4 溶血试验:将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20个~25个小格,挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上,每格刺种一个菌落,并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌),穿刺时尽量接近底部,但不要触到底面,同时避免琼脂破裂,36℃±1℃培养24h~48h,于明亮处观察,单增李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈,英诺克李斯特氏菌无溶血圈,伊氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的β-溶血区域,若结果不明显,可置4℃冰箱24h~48h再观察。
注:也可用划线接种法。
5.4.5 协同溶血试验cAMP(可选项目):在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌,挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间,垂直线两端不要触及平行线,距离1mm~2mm,同时接种单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌,于36℃±1℃培养24h~48h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm 的β-溶血增强区域,斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域,伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5mm~10mm 的“箭头状”β-溶血增强区域,英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。若结果不明显,可置4℃冰箱24h~48h再观察。
注:5%~8%的单核细胞增生李斯特氏菌在马红球菌一端有溶血增强现象。
表1 单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别
5.5 小鼠毒力试验(可选项目)
将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中,于36℃±1℃培养24h,4000r/min离心5min,弃上清液,用无菌生理盐水制备成浓度为1010 CFU/mL的菌悬液,取此菌悬液对3只~5只小鼠进行腹腔注射,每只0.5mL,同时观察小鼠死亡情况。接种致病株的小鼠于2d~5d内死亡。试验设单增李斯特氏菌致病株和灭菌生理盐水对照组。单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。
5.6 结果与报告
综合以上生化试验和溶血试验的结果,报告25g(mL)样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。
第二法 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法
6 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序见图2。
7 操作步骤
7.1 样品的稀释
7.1.1 以无菌操作称取样品25g(mL),放入盛有225mL 缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌均质袋内(或均质杯)内,在拍击式均质器上连续均质1min~2min或以8000r/min~10000r/min均质1min~2min。液体样品,振荡混匀,制成1∶10的样品匀液。
7.1.2 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
7.1.3 按7.1.2操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。
7.2 样品的接种
根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),每个稀释度的样品匀液分别吸取1mL以0.3mL、0.3mL、0.4mL的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板,用无菌L 棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如琼脂平板表面有水珠,可放在25℃~50℃的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。
7.3 培养
7.3.1 在通常情况下,涂布后,将平板静置10min,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36℃±1℃培养1h;等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,36℃±1℃培养24h~48h。
7.4 典型菌落计数和确认
7.4.1 单核细胞增生李斯特氏菌在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征以产品说明为准。
7.4.2 选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在15CFU~150CFU 之间的平板,计数典型菌落数。如果:
a) 只有一个稀释度的平板菌落数在15CFU~150CFU 之间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落;
b) 所有稀释度的平板菌落数均小于15CFU 且有典型菌落,应计数最低稀释度平板上的典型菌落;
c) 某一稀释度的平板菌落数大于150CFU 且有典型菌落,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀释度平板上的典型菌落;
d) 所有稀释度的平板菌落数大于150CFU 且有典型菌落,应计数最高稀释度平板上的典型菌落;
e) 所有稀释度的平板菌落数均不在15CFU~150CFU 之间且有典型菌落,其中一部分小于15CFU 或大于150CFU时,应计数最接近15CFU或150CFU的稀释度平板上的典型菌落。
以上按式(1)计算。
f) 2个连续稀释度的平板菌落数均在15CFU~150CFU 之间,按式(2)计算。
7.4.3 从典型菌落中任选5个菌落(小于5个全选),分别按5.3、5.4进行鉴定。
8 结果计数
T =AB/Cd …………………………(1)
式中:
T ———样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;
A ———某一稀释度典型菌落的总数;
B ———某一稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;
C ———某一稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;
d ———稀释因子。
T =（A1B1/C1 +A2B2/C2）/1.1d …………………………(2)
式中:
T ———样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;
A1 ———第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;
B1 ———第一稀释度(低稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;
C1 ———第一稀释度(低稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;
A2 ———第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;
B2 ———第二稀释度(高稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;
C2 ———第二稀释度(高稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;
1.1 ———计算系数;
d ———稀释因子(第一稀释度)。
9 结果报告
报告每g(mL)样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数,以CFU/g(mL)表示;如T 值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
第三法 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法
10 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法检验程序见图3。
11 操作步骤
11.1 样品的稀释
按7.1进行。
11.2 接种和培养
11.2.1 根据对样品污染状况的估计,选取3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),接种于10mLLB1 肉汤,每一稀释度接种3管,每管接种1mL(如果接种量需要超过1mL,则用双料LB1增菌液)于30℃±1℃培养24h±2h。每管各移取0.1mL,转种于10mLLB2 增菌液内,于30℃±1℃ 培养24h±2h。
11.2.2 用接种环从各管中移取1环,接种李斯特氏菌显色平板,36℃±1℃培养24h~48h。
11.3 确证试验
自每块平板上挑取5个典型菌落(5个以下全选),按照5.3、5.4进行鉴定。
12 结果与报告
根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数,查MPN 检索表(见附录B),报告每g(mL)
样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数,以MPN/g(mL)表示。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)
A.1.1 成分
胰胨17.0g
多价胨3.0g
酵母膏6.0g
氯化钠5.0g
磷酸氢二钾2.5g
葡萄糖2.5g
蒸馏水1000mL
A.1.2 制法
将上述各成分加热搅拌溶解,调节pH 至7.2±0.2,分装,121℃高压灭菌15min,备用。
A.2 含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)
A.2.1 成分
胰胨17.0g
多价胨3.0g
酵母膏6.0g
氯化钠5.0g
磷酸氢二钾2.5g
葡萄糖2.5g
琼脂15.0g
蒸馏水1000mL
A.2.2 制法
将上述各成分加热搅拌溶解,调节pH 至7.2±0.2,分装,121℃高压灭菌15min,备用。
A.3 李氏增菌肉汤(LB1,LB2)
A.3.1 成分
胰胨5.0g
多价胨5.0g
酵母膏5.0g
氯化钠20.0g
磷酸二氢钾1.4g
磷酸氢二钠12.0g
七叶苷1.0g
蒸馏水1000mL
A.3.2 制法
将上述成分加热溶解,调节pH 至7.2±0.2,分装,121℃高压灭菌15min,备用。
A.3.2.1 李氏Ⅰ液(LB1)225mL中加入:
1%萘啶酮酸(用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制)0.5mL
1% 吖啶黄(用无菌蒸馏水配制) 0.3mL
A.3.2.2 李氏Ⅱ液(LB2)200mL中加入:
1%萘啶酮酸0.4mL
1%吖啶黄0.5mL
A.4 PALCAM 琼脂
A.4.1 成分
酵母膏8.0g
葡萄糖0.5g
七叶甙0.8g
柠檬酸铁铵0.5g
甘露醇10.0g
酚红0.1g
氯化锂15.0g
酪蛋白胰酶消化物10.0g
心胰酶消化物3.0g
玉米淀粉1.0g
肉胃酶消化物5.0g
氯化钠5.0g
琼脂15.0g
蒸馏水1000mL
A.4.2 制法
将上述成分加热溶解,调节pH 至7.2±0.2,分装,121℃高压灭菌15min,备用。
A.4.2.1 PALCAM 选择性添加剂
多粘菌素B 5.0mg
盐酸吖啶黄2.5mg
头孢他啶10.0mg
无菌蒸馏水500mL
A.4.2.2 制法
将PALCAM 基础培养基溶化后冷却到50℃,加入2mLPALCAM 选择性添加剂,混匀后倾倒在无菌的平皿中,备用。
A.5 革兰氏染色液
A.5.1 结晶紫染色液
A.5.1.1 成分
结晶紫1.0g
95%乙醇20.0mL
1%草酸铵水溶液80.0mL
A.5.1.2 制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
A.5.2 革兰氏碘液
A.5.2.1 成分
碘1.0g
碘化钾2.0g
蒸馏水300mL
A.5.2.2 制法
将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。
A.5.3 沙黄复染液
A.5.3.1 成分
沙黄0.25g
95%乙醇10.0mL
蒸馏水90.0mL
A.5.3.2 制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
A.5.4 染色法
A.5.4.1 涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液,作用1min,水洗。
A.5.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。
A.5.4.3 滴加95%乙醇脱色,约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。
A.5.4.4 滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。
A.6 SIM 动力培养基
A.6.1 成分
胰胨20.0g
多价胨6.0g
硫酸铁铵0.2g
硫代硫酸钠0.2g
琼脂3.5g
蒸馏水1000mL
A.6.2 制法
将上述各成分加热混匀,调节pH 至7.2±0.2,分装小试管,121℃高压灭菌15min,备用。
A.6.3 试验方法
挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM 培养基中,于25℃~30℃培养48h,观察结果。
A.7 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR 和VP试验用)
A.7.1 成分
多价胨7.0g
葡萄糖5.0g
磷酸氢二钾5.0g
蒸馏水1000mL
A.7.2 制法
溶化后调节pH 至7.0±0.2,分装试管,每管1mL,121℃高压灭菌15min,备用。
A.7.3 甲基红(MR)试验
A.7.3.1 甲基红试剂
A.7.3.1.1 成分
甲基红10mg
95%乙醇30mL
蒸馏水20mL
A.7.3.1.2 制法
10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中,然后加入20mL蒸馏水。
A.7.3.1.3 试验方法
取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中,36℃±1℃培养2d~5d。滴加甲基红试剂一滴,立即观察结果。鲜红色为阳性,黄色为阴性。
A.7.4 V-P试验
A.7.4.1 6% α-萘酚-乙醇溶液
成分及制法:取α-萘酚6.0g,加无水乙醇溶解,定容至100mL。
A.7.4.2 40%氢氧化钾溶液
成分及制法:取氢氧化钾40g,加蒸馏水溶解,定容至100mL。
A.7.4.3 试验方法
取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中,36℃±1℃培养2d~4d。加入6% α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL,充分振摇试管,观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色,如为阴性,应放在36℃±1℃继续培养1h再进行观察。
A.8 血琼脂
A.8.1 成分
蛋白胨1.0g
牛肉膏0.3g
氯化钠0.5g
琼脂1.5g
蒸馏水100mL
脱纤维羊血5mL~8mL
A.8.2 制法
除新鲜脱纤维羊血外,加热溶化上述各组分,121℃高压灭菌15min,冷到50℃,以无菌操作加入新鲜脱纤维羊血,摇匀,倾注平板。
A.9 糖发酵管
A.9.1 成分
牛肉膏5.0g
蛋白胨10.0g
氯化钠3.0g
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 2.0g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0mL
蒸馏水1000mL
A.9.2 制法
A.9.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后,按0.5%比例加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内,调节pH 至7.4,115℃高压灭菌15min,备用。
A.9.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100mL,115℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内,以无菌操作分装于含倒置小管的小试管中。或按照A.9.2.1葡萄糖发酵管的配制方法制备其他糖类发酵管。
A.9.3 试验方法
取适量纯培养物接种于糖发酵管,36 ℃±1 ℃培养24h~48h,观察结果,蓝色为阴性,黄色为阳性。
A.10 过氧化氢酶试验
A.10.1 试剂
3%过氧化氢溶液:临用时配制。
A.10.2 试验方法
用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落,置于洁净玻璃平皿内,滴加3%过氧化氢溶液2滴,观察结果。
A.10.3 结果
于半分钟内发生气泡者为阳性,不发生气泡者为阴性。
A.11 缓冲蛋白胨水(BPW)
A.11.1 成分
蛋白胨10.0g
氯化钠5.0g
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 9.0g
磷酸二氢钾1.5g
蒸馏水1000mL
A.11.2 制法
加热搅拌至溶解,调节pH 至7.2±0.2,121℃高压灭菌15min。
附 录 B
单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN)检索表
每g(mL)检样中单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN)检索表见表B.1。
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