抗生素检定用芽孢悬液的制备及注意事项

   管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。其中，芽孢悬液的制备就有很多需要注意的地方。

   在用管碟法检定抗生素时，需要将菌悬液与培养基混合均匀、覆盖在底层培养基上，以形成抑菌圈。其中，对于菌悬液的制备要求为：

   将所用菌的斜面培养物用1~2ml灭菌水洗下，形成菌悬液；将菌悬液在营养琼脂平皿上均匀涂布，置于35-37℃条件下培养7天；涂片、染色，镜检芽孢率≥85%时，用10ml灭菌水将芽孢和菌体的混合物洗下，制成悬液；65℃水浴加热30min，杀死菌体，形成有活性的芽孢悬液；冷却、冰箱中保存备用。

   根据实际操作中的经验，对这一环节需要注意的事项总结如下：

   1 应该严格按照标准操作，将涂好的平皿连续培养7天再洗脱芽孢，这样也有助于芽孢悬液的均一性，避免由于操作标准不一造成的试验结果的偏差。有文章报道，将平板培养至2、3、4、5、6天与培养至第七天，制成的悬液在抗生素效价测定中无差异；但本人在实际试验中发现，培养3天的短小芽孢菌，镜检时芽孢率<80%,并且平皿一旦从培养箱中拿出来，室温放置至第10天，芽孢率也不会再发生明显变化，这显然不符合《中国兽药典》规定的芽孢率≥85%的要求。

   2试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。故检定时应保持菌种及菌液的新鲜。一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存。对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次。
   3 试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异。芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65℃加热30分钟，使菌体的菌龄一致（有资料显示可70-75℃水浴30min杀死菌体）。
   4 加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的1%（有资料说不大于2%）。如果加入菌悬液的体积过小，则在同次实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大， 造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养基结块，影响测定结果。对于加入菌悬液体积的控制，可通过调节菌悬液的浓度来实现。

  下面为在海博生物技术公司生产的抗生素检定Ⅳ号琼脂上，莫能菌素对短小芽孢菌的抑菌效果：

图a  连续培养7天的短小芽孢菌

图b  莫能菌素对短小芽孢菌的抑菌效果

   从照片可以看出，菌悬液中芽孢率符合要求（≥85%），抑菌圈透明、边缘清晰且直径均匀，符合标准规定的18-22mm，效果非常好！

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