伊红美兰琼脂（EMB琼脂）的原理及使用

一、试验原理：

   伊红美兰培养基（简称EMB medium）主要用于大肠杆菌和产气肠杆菌的分离和鉴别。

   其配方中各主要成分的作用为：蛋白胨提供碳源和氮源；乳糖是大肠菌群发酵的糖类；磷酸氢二钾是缓冲剂；琼脂是培养基凝固剂；伊红（Eosin Y）也称曙红或四溴荧光素，为酸性染料，美兰（eosin-methylene blue），也叫亚甲蓝（C16H18N3S·Cl），为碱性染料，二者在培养基中均为指示剂。

   当大肠杆菌分解乳糖产酸时，细菌带正电，所以染上红色，再与美兰结合而形成紫黑色菌落，并带有金属光泽；产气肠杆菌则呈棕色，很少有金属光泽。不分解乳糖的细菌，如沙门氏菌和志贺氏菌，则为无色或琥珀色半透明菌落；凝固酶阳性葡萄球菌为无色针尖大小的菌落；白色念珠菌则为蛛丝状或羽毛状菌落。

   因该培养基抑制作用较弱，不宜用于肠道致病菌的分离。有资料称往该培养基中加入盐酸金霉素，可以抑制大部分杂菌，以用于临床尿、大便、口腔和阴道分泌物，指甲或皮肤屑中白色念珠菌的快速鉴定。还有报道称，本培养基可用于检查凝固酶阳性葡萄球菌，其结果与凝固酶试验相一致。

二、试验操作方法

   用伊红美蓝培养基鉴定水中大肠杆菌，步骤如下:

   ①制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

   ②用高温灭菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1:10稀释。

   ③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。用平板划线分离法进行分离。

   ④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18~24小时。培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。

   ⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）。

三、常见问题

   问：GB/T 5750.12-2006标准中说大肠菌群初发酵阳性后，“将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上”，怎么转种到伊红美蓝琼脂平板上啊？是先配好伊红美蓝倾倒在培养皿上，待琼脂凝固后，划线接种，还是先吸取1mL的发酵液注入到培养皿上，再倾倒15-20mL的琼脂，待凝固后倒置培养，就像食品中菌落总数检测方法那样呢？

   答：就是先配好伊红美蓝倾倒在培养皿上，待琼脂凝固后，划线接种，这样可以看到典型菌落形态；然后找一些典型或可疑菌落做下一步验证实验就可以了。

   问： 那划线接种所用的工具是接种环还是别的东西？以前没实践过平板划线这个实验，所以不太了解。另外标准上说的菌落总数培养基是营养琼脂，用的和正常检测食品的PCA计数平板是一个东西吗？

   答：接种用的是接种环。菌落总数用的营养琼脂和检测食品的PCA差不多，但PCA的营养成分还要高一些。

   问：我实验条件有限，没有乳糖和伊红。乳糖能否用蔗糖代替？伊红能否用红墨水干了后的东西代替（我看见某网站上说红墨水用的是伊红）？

   答：常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H+，故菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽。乳糖是一个半乳糖和一个葡萄糖构成，蔗糖是一个果糖和一个葡萄糖形成的。所以乳糖是必须的，因为牵涉到细菌产酸底物的特异性。

   另外你用红墨水，不怕里面的某些成分把细菌杀死吗？并且墨水不一定是伊红配成的，而且墨水成分也不仅仅是伊红，如果你自行代替，至少我是不会承认你的实验结果是有效的，因为你都说不清楚培养基里到底有什么。

   问：培养基里的磷酸盐是干嘛的？不加可以吗？

   答：磷酸氢盐是作为pH缓冲剂添加的，如果培养时间不长的话，不加也无妨。培养时间长的话，大肠杆菌等细菌分解乳糖产酸导致pH下降，会抑制不耐酸细菌的生长。

   问：请问在做大肠菌群的检测过程中，在配制伊红美兰琼脂培养基时，乳糖、伊红和美兰溶液要灭菌吗？

   答：需要灭菌。

   问：显色培养基，个人觉得还是买成品好！现在发现自己比较难配，而且试剂店的这种冷门试剂很多都是长时间存放的，难免变质，再说个人每次用量太少，买一盒试剂又贵又用不完。要是有成品的这种培养基就好了！不知道哪里有卖的？能不能给推荐一下？

   答：现在很多生物试剂都有成品，自己根本不用配。就拿EMB培养基来说吧，我们青岛海博生物计数公司就有好几个产品类型，有干粉、颗粒、甚至还有直接可以拿来用的倒好的无菌平板，都是针对不同用户需求专门制作的。

   问：该产品可靠吗？质量怎么保证？

   答：成品培养基出厂前都是经过质量检测的。您要不放心也可以再自己做一下。

   问：能详细介绍一下你们的EMB琼脂平板这款产品吗？

   答：

  【产品名称】伊红美蓝平板

  【规格】90mm

  【用途】供作肠道致病菌及大肠菌群的分离培养

  【使用步骤】
   1、复温：取出培养基复温至室温；
   2、接种：将需要接种的预稀释好的标本或菌株用无菌移液管吸取一定量后移至平板，然后慢慢释放，释放的同时将移液管作“Z”字形移动，或采用划线、涂布、其它常用方法接种于培养基皆可；
   3、培养：将接种好的培养基作好标识，置于35±2℃恒温培养箱中培养24～48h后取出，观察结果。
  【预期结果】

   根据菌落形态，做出相应的处理或报告。据检验目的不同，挑取无色菌落或挑选引线红色及有金属光泽的菌落转种到克氏双糖或三糖铁琼脂进行鉴定。
  【注意事项】
   1、检查平板内是否干裂或染菌，如上面有菌请勿使用；
   2、请在洁净的环境下操作，避免杂菌干扰；
   3、培养时培养基平板应倒置于培养箱中，避免接触培养箱壁和底部以致培养基过热干缩；
   4、拆封后未使用完的培养基要及时放到冰箱冷藏储存，避免干裂；
   5、在冰箱储存很久的培养基容易出现一些冷凝水，请在洁净的环境下将水倒出，然后在培养箱放置一段时间，待其表面干燥后再接种；
   6、弃物处理：使用后应高压灭菌或焚烧后方可按一般垃圾处理，也可按专业技术人员指示方法处理。
  【贮藏】2～8℃,避光储存，拆封后及时放入冰箱冷藏
  【有效期】3个月
  【生产日期及批号】见标签或外包装

   问：这个方便多了，反正用的量也不是太多的！再问一个问题，为什么要把水样和融化的培养基混合？不会使菌落数偏少吗？

   答：待测液是应该和培养基混合，俗称混平板法。当然，你选择涂平板也没有问题。混平板法会杀死不耐热的细菌，平板法会对细菌造成机械损伤，各有利弊。

   个人经验是一个9cm平板倒入培养基后吹干表面的水，加入500ul水样反复倾斜平板使得水样涂遍培养基，然后吹干即可。

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