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实验室无菌环境怎样监控和检测?



录入时间:2017-7-12 15:34:44 来源:食品实验室服务

    微生物检测人员天天都需要在无菌室工作,在超净台或者生物安全柜里操作,为了保证我们检测的准确性,我们必须要求无菌室以及工作台符合要求,那我们应该怎样进行验证呢?下面我们介绍一下环境中无菌或杀菌效果应如何检查。

一、紫外灯杀菌效果检查

    紫外灯在使用过程中辐射强度会逐渐降低,影响其杀菌效果,故应该定期检查。紫外灯的杀菌有效波长是253.7nm,其强度可以用中心波长254nm的紫外线强度计测定。在没有紫外线强度计的情况下可以采用生物学替代。

    生物学测试简要步骤如下:选用枯草芽孢杆菌ATCC 9372,制成106CFU/mL~108CFU/mL浓度的菌悬液;选用经脱脂处理的0.5cm×1.0cm大小的布片或铝片,高压灭菌后用作载体;每个载体上滴一滴制备好的菌悬液,干燥后备用;将8个染菌载体放于无菌器皿中,置于紫外灯下1m~1.5m处,开启紫外灯照射,于0.5h、1h、1.5h和2h各取出2个染菌载体,分别投入盛有5mL缓冲蛋白胨水的洗脱液;系列稀释后进行平板计数;同法取8个染菌载体用做阳性对照,操作除不经紫外此昂照射外与试验组相同。

    杀灭率=(阳性对照回收菌数-试验组回收菌数)/阳性对照回收菌数×100%

    杀灭率大于99.9%时,认为紫外灯杀菌效果合格。

二、无菌室空气质量检查

    无菌室空气质量检查应按照采样计划,根据情况对处于空态、静态和正常运行的风险区,使用适当的仪器采集空气中微生物,测定并监控风险区空气的微生物污染。空气悬浮微生物的采样和计数方法多种多样,根据多需采样目的决定具体的采样方法和采样器。因采样器的采集效率不同,应慎重选择合适的方法和设备。采样器分为两类:被动式采样器,如落菌盘;主动式采样器,如过滤采样器、撞击采样器、冲击采样器等。

1.沉降法

    落菌盘等被动式空气微生物采样器不能测量空气中的微生物的总数,而是测量空气中微生物在表面的沉降率。只要确定单位时间落菌盘上微生物的数量,再根据落菌盘的暴露面积与暴露时间之间的关系,即可大致计算出空气中微生物的数量。

    面积小于30m2的室内设一条对角线取3点,在其中心以及两端距墙1m处各取1点;面积大于30m2的室内房间四面距墙1m和中央各放置一个平皿,高度为实验台高度。培养基平皿开盖暴露10min,然后盖上盖子倒放,培养48h,计数每个平皿上的菌落数。

    日常监控时,可以设定可接受的菌落数限值。一般无菌室所有的取样平皿上的细菌总数应小于15个。空气质量良好的无菌室,通常么个平皿上生长的细菌不超过2个。

2.空气过滤法:

    空气采样除了自然沉降法外,还可以使用专门的主动式采样器。主动式采样器可以评估风险区空气微生物的特征。主动式采样器主要包括过滤采样器、撞击采样器、冲击采样器等。

    撞击采样器可以分为狭缝式采样器、离心式采样器和针孔式采样器。狭缝式采样器由附加的真空抽气泵抽气,通过采样器的缝隙式平板,将采集的空气喷射并撞击到缓慢旋转的平板培养基表面上,附着的活微生物粒子经过培养后形成菌落,予以计数。离心式采样器由于内部风机的高速旋转,气流从采样器前部吸入从后部流出,在离心机的作用下,空气中的活微生物粒子有足够的时间撞击到专用的固形培养条上,经培养后形成菌落,予以计数。

    过滤式空气采样器是最常用、最简单的空气采样器。过滤式采样器有采样头、滤器、流量计和抽气泵组成。过滤式采样器的结构如图:

 

    开动电机后,抽气泵工作,带动空气吸入采样头,空气通过滤器的时候,大于滤膜孔径的颗粒被阻留,当达到预先设定吸气体积后抽气泵停止工作,将滤膜取出转贴到培养基上,培养后计算空气中微生物的浓度。过滤式采样器捕获效率高,但是滤膜材料可能影响微生物的存活率,还有采样阻力大、流量易变的缺陷。

    在没有空气采样器的情况下,可以自己组装如下图的空气错率采样装置,注意组装连接处必须密不透风。

 

    打开图中大瓶的龙头,空气就被抽入无菌水中。待4L水流完,就有4L空气通过小瓶中的无菌水,也就是4L空气中的微生物被留存在50mL无菌水中。无菌吸取1mL过滤的水样进行平板计数,做2个平行。37℃培养48h计数。

    每升空气中的细菌数为:2个平皿上细菌数量的平均值×50/4。

三、无菌室物体表面微生物污染检查

    表面微生物污染的检查需要使用接触器或拭子,获得某表面某时间点的微生物数量。

    接触器以容器内已知面积的固态培养介质与表面接触,接触面积应大于20cm2,均匀用力将整个营养介质压住表面几秒钟,不得移动。然后将装置放回容器内,再清洁采样表面,清除残留营养物。接触器培养后显现的菌落可以给出原表面微生物的存活状况的镜像“图”。

    使用拭子更为简单和灵活,用拭子擦拭某个表面,它抹去的微生物数量就可以计算出了。对接触装置触及不到的、不平或有凹陷的非吸收性大表面,用拭子采样特别方便。棉拭子的操作方法如下:

准备材料:自制无菌棉拭子或购买商品化的无菌棉拭子、内径10cm×10cm无菌规格板、无菌生理盐水、培养基平皿。

    如果取样物体是平面的,将无菌规格板放在物体表面,用浸湿的无菌棉拭子在无菌规格板空心处横竖涂抹均匀,涂抹时随之转动棉拭子,剪去棉拭子与手接触部分,将棉拭子放入装有一定体积的无菌生理盐水中待检。

    将采样管敲打80次以上是棉拭子上的细菌充分扩散,做适当稀释,进行平板计数,37℃培养48h计数。

细菌总数(CFU/cm2)=(平皿上菌落平均数×稀释倍数)/采样面积(cm2)

四、人员接触面无菌检查

    被检人员洗手消毒后,五指并拢。将浸泡过的棉拭子沿双手指屈从指根到指端往返涂擦两次,涂擦的同时转动棉拭子。剪去操作者手接触部位,将棉拭子放入装有一定体积的无菌室生理盐水中待检。

    按“无菌室物体表面细菌污染检查”的方法进行样品处理、接种、培养、计数和报告结果。

 

 

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