微生物无菌取样技术

    无菌样品的采集基本是为了支持、针对工厂的卫生条件状况的检查结果。

   一、检验前的准备工作：

   1．包装无菌取样的工具：
   拥有正确的采取产品或加工过程的无菌取样器械工具是至关重要的。除非使用合适的采集工具，否则样品的完整性会被怀疑，甚至样品毫无意义。为了避免没有合适的取样工具，建议建立一个无菌取样的分析清单，来收集取样工具。如果可能盛样品的容器在最初进入加工区之前应当被预先标识，像样品号、取样日期、取样人等。这样可以使在不同的工厂条件下的样品取样更为方便一些。附加样品号码一般在样品采集中被正式确定下来，因此不用预先标明。
   人员的工具设施，象工作服、发网或消毒处理过的清洁的鞋靴必须具备有助于证明采集者没有污染到食物产品或样品。

   2．生产线样品 In-Line Samples：
   生产线样品一般是指原材料，原料生产用水、包装材料或其他任何使用在生产线的材料。
   生产线样品的采集一般用来确定细菌污染源是否来自于原材料或加工序中的某些地方。

   3．环境样品：
   环境样品用细菌拭子，（注：细菌拭子样品不能给出/测出微生物的定时结果，因为样品非常小，显著微生物会经常丢失），棉拭子的取样部位一般来自于食品接触面，地板喷溅物。墙壁、顶部管道和检验中考察的其他潜在污染源程序，并且记录可能的联系，在环境样品来源和食物产品的污染方面，可以使样品具有意义，并且是提倡这样做的，例如：
   地面喷溅水：工人从有地面污水的地方走过后又回到加工区域吗？
   墙壁：墙壁上面和在制品上面有昆害虫吗？
   天花板：冷凝物或喷漆有无掉落到产品上或被发现与产品相接触？

   4．某些准备
   干冰：（有的称为 gel backs）如果使样品在贮运过程中保持冷却，一些种类的制冷剂是必需的。检查观看干冰袋子是否有接触，如果泄漏可能污染样品，你也可以用湿冰，湿冰可以由工厂提供，然而取样前必须清楚这一点，如果想保持样品冷冻，干冰应在检验前获得。

   盒子或制冷皿：
   检验员需要贮藏、运输他们的样品，如果样品不需冷冻，那么用一个盒子即可，但如果样品需要冷却，一个标准的制冷皿或保温箱是必须使用的，一般来讲制冷皿随带着一个塑料袋，样品可以放还袋子里，制冷剂象干冰，等可以放置在袋外，这样样品被冰污染的可能性就被避免了。

   灭菌容器：
   从塑料袋到灭菌的加仑漆桶，可以用于有锐利边面的产品如蟹、虾等。

   取样工具：
   取样工具包括：茶匙、角匙、尖嘴钳、 fovceps tongs 量筒和烧杯，工具的类型一般由取样产品来决定。
   所有取样设施和容器的灭菌日期应当被检查、灭菌时间应当在仪器设施的标签和包装上标明，一些仪器设施可以在当地实验室灭菌处理或购买灭菌仪器，在当地实验室灭菌的仪器设施一般可以保持至少两个月，过期后设施必须重新灭菌。

   灭菌手套：
   灭菌手套在采样中并非必须启用，如果一个产品在样品收集过程中必须被接触，那么最好让工厂生产线的工人来做（加工处理产品的工人），将样品放入收集容器中，既然工人在生产过程中处理接触产品，那么我们就不能认为他们对产品又有附加的污染。
   当用手套时必须用一种避免污染的方式戴上，手套的大小必须适合工作的需要。

   无菌棉拭子：
   一般用于拭取仪器设施和工厂环境区域，使用棉拭子一般有一个正确的程序，打开棉拭子剥掉表皮，然后必须小心的放在试管头上，注意不要沾染棉拭子的外端；下一步擦拭要取样的部位，像案板头或顶部管道，然后从试管头上小心翼翼地将拭子放入——将其全部堆入直到试管中部。

   灭菌全包装袋：
   袋子必须购买灭菌的，使用时只需撕掉封头，用提供的地方张开袋子，将样品放入，然后将袋子顶端卷起，用线绳扎实牢；底部应当折叠两次，以便线绳不会穿透塑料袋，导致样品泄露。
   当样品收集时，样品采集时的条件例如产品的温度、地点等，连同扦样样品号唛头，一并记录入检验员的注释说明中，取样的样品可以从样品号、采集日期、附加样品号，最初调查人和其他鉴别信息事区分。
   当采集无菌样品时，一条最重要的规则是：千万别污染样品。
   这需要样品采集人非常小心地采集所有附加样品，确保不违反这条规则。

   二、取样方案

   微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要有一套科学的抽样方案，其次使用正确的抽样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。
   一般说来，进出口贸易合同对食品抽样量有明确规定的，按合同规定抽样；进出口贸易合同没有具体抽样规定的，可根据检验的目的，产品及被抽样品批的性质和分析方法的性质确定抽样方案。目前最为流行的抽样方案为 ICMSF 推荐的抽样方案和随机抽样方案，有时也可参照同一产品的品质检验抽样数量抽样，或按单位包装件数 N 的开平方值抽样。无论采取何种方法抽样，每批货物的抽样数量不得少于 5 件。对于需要检验沙门氏菌的食品，抽样数量应适当增加，最低不少于 8件。

   ICMSF 推荐的抽样方案
   ICMSF 的采样设想及其基本方法

   用于分析所抽样品的数量、大小和性质对结果会产生很大影响。在某些情况下
   用于分析的样品可能代表所抽“一批”（ lot） 样品的真实情况，这适合于可充分混合的液体，如牛奶和水。
   在“多批”（ Lots 或“ batchers”）食品的情况下就不能如此抽样，因为“一批”容易包含在微生物的质量上差异很大的多个单元。因此在选择抽样方案之前，必须考虑诸多因素（ ICMSF， 1986），包括：

   ——检验目的
   ——产品及被抽样品的性质
   ——分析方法

   ICMSF 提出的采样基本原则，是根据（1）各种微生物本身对人的危害程度各有不同。（2）食品经不同条件处理后，其危害度变化情况：①降低危害度；②危害度未变；③增加危害度，来设定抽样方案并规定其不同采样数。目前，加拿大、以色列等很多国家已采用此法作为国家标准。在进行详细叙述之前，先解释四个代号：
   n：系指一批产品采样个数。
   c：系指该批产品的检样菌数中，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。
   m：系指合格菌数限量，将可接受与不可接受的数量区别开。
   M：系指附加条件，判定为合格的菌数限量，表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的界限。

   1. ICMSF的采样方法
   有些实验室在每批产品中，仅采一个检样进行检验，该批产品是否合格，全凭这个检样来决定。 ICMSF方法与此不同，它是从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该产品的质量而设定的。
   ICMSF方法中包括二级法及三级法两种。二级法只设有 n、 с 及 m值，三级法则有 n、 c、 m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。

   （1）二级抽样方案。自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准 m值，超过m值的，则为不合格品。
检查在检样是否有超过m值的，来判定该批是否合格。以生食海产品鱼为例n=5， c=0， m=10²， n=5 即抽样5 个， c=0 即意味着在该批检样中，未见到有超过m值的检样，此批货物为合格品。

   （2）三级抽样方案。设有微生物标准m及M值两个限量如同二级法，超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过 M值者，则为不合格。例如：冷冻生虾的细菌数标准n=5， c=3， m=10¹， M=10²，其意义是从一批产品中，取 5 个检样，经检样结果，允许≤3个检样的菌数是在 m到M值之间，如果有3 个以上检样的菌数是在m到M 值之间或一个检样菌数超过 M 值者，则判定该批产品为不合格品。

   （3）ICMSF 对食品中微生物的危害度分类与抽样方案说明
为了强调抽样与检样之间的关系， ICMSF 已经阐述了把严格的抽样计划与食品危害程度相联系的概念（ ICMSF， 1986）。在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案，对健康危害低的则建议使用三级抽样方案。
   ICMSF 是将微生物的危害度、食品的特性及处理条件三者综合在一起进行食品中微生物危害度分类的。这个设想是很科学的，符合实际情况的，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。下面结合表1加以说明。

   表 1 ICMSF 按微生物的危害度及食品处理进行情况分类

   注：表中“减少”系指食品经加热杀死污染的细菌。
   “无变化”系指微生物数不增减例如冷冻食品或干燥食品。

   “增加”系指将食品保存在不良环境中使微生物易于繁殖和产毒。
   根据上表 15 种情况的举例， 1-3 可用三级法， 4-5 可用二级法来判定是否合格。
   考虑到以上 15 种情况，分别设定不同的取检样数及检样污染数，在 1-9 例检样需采 5 个（ n=5），而污染检样数设定为 c=3， 2， 1。在 10-15 例用二级法则不得检出该致病菌 c=0。例如冷冻食品，细菌数按例 2，大肠菌按例 5，金黄色葡萄球菌按例 8，沙门氏菌按例 11 的二级法判定。
   对食品处理应酌情考虑，例如生肉火腿中的金黄色葡萄球菌，被腐败菌所抑制，不易发生食物中毒，适用例 7 和例 8。烹调加工后的熟肉，对腐败菌没有抵抗力，则易发生食物中毒，适用例 9。加热盐腌的火腿，水分活性为 0.86 以下，金黄色葡萄球菌有增殖的可能性，因此适用例 9。沙门氏菌水活性在 0、 94 以下不能繁殖，适用例 11，如上所述，应根据各种食品的危害度进行设定。
   ICMSF 方法是以二级法、三级法和抽样的概念为基础，再将微生物的知识加进来，则可以提出各种食品的微生物标准。如表 2。
   为了安全，冷冻生虾加热吃，减少危害度适用例 1、 4、 10。冷冻加工虾，为了不加热就食，在解冻中有增强危害度的可能性，适用例 3、 6、 9、 12，对象微生物特别指定金黄色葡萄球菌肠毒素，两者虽菌数限量是相同的，但情况有所不同，分别适用 c=3， c=1，因此不依靠菌数限量，而用合格率来控制。

   表 2、 ICMSF 虾的微生物标准

   （4）随机抽样方案
   在现场抽样时，可利用随机抽样表进行随机抽样。随机抽样表系用计算机随机
   编制而成，包括一万个数字。其使用方法如下：

   a.先将一批产品的各单位产品（如箱、包、盒等）按顺序编号。如将一批 600包的产品编为 1、 2…600。
   b.随意在表上点出一个数。查看该数字所在的行和列。如点在第 48 行、第 10列的数字上。
   c.根据单位产品编号的最大位数（如 A1，最大为三位数），查出所在行的连续列数字（如 A2 所点数为第 48 行、第 10、 11 和 12 列，其数字为 245），则编号与该数相同的那一份单位产品，即为一件应抽取的样品。
   d.继续查下一行的相同连续列数字（如按A3、即第49 行的第10、 11 和12列的数字，为608）。该数字所代表的单位产品为另一件应抽取的样品。
   e.依次按A4所述方法查下去。当遇到所查数超过最大编号数量（如第50行的第10、11和12列的数字为931、大于600）则舍去此数，继续查下一行相同列数，直到完成应抽样品件数为止。
 

   三、抽样方法
   确定了抽样方案以后，抽样方法对抽样方案的有效执行和保证样品的有效性代表性至关重要。抽样必须遵循无菌操作程序，抽样工具如整套不锈钢勺子、镊子、剪刀等应当高压灭菌，防止一切可能的外来污染。容器必需清洁、干燥、防漏、广口、灭菌，大小适合盛放检样。抽样全过程中，应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。确定检验批，应注意产品的均质性和来源，确保检样的代表性。常见的抽样方法有：

   1．直接食用的小包装食品：
   尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。

   2．统装或大容器包装的液体食品：

   （1）抽样前摇动或用灭菌棒搅拌液体，尽量使其达到均质；
   （2）抽样时应先将抽样用具浸入液体内略加漂洗，然后再取所需量的样品，装人灭菌盛样容器的量，不应超过其容量的四分之三，以便于检验前将样品摇匀；
   （3）取完样品后，应用消毒的温度计插入液体内测量食品的温度，并作记录。尽可能不用水银温度计测量，以防温度计破碎后水银污染食品；
   （4）如为非冷藏易腐食品，应迅速将所抽样品冷却至0-4℃。

   3．统装或大容器包装的固体和固体食品：
   （1）每份样品应用灭菌抽样器由几个不同部位采取，一起放入一个灭菌容器内；
   （2）注意不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。

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