隔离系统环境监测平皿微生物试验回收率的影响因素

  为研究无菌检查用隔离系统环境监测平皿微生物试验回收率的影响因素，本文对不同来源的环境监测平皿进行了测试。通过微生物的回收率作为评价指标，评估包装材料、灭菌剂注入量、灭菌循环次数等因素对回收率的影响。结果表明，灭菌剂注入量、包装材料和包装形式对环境监测平皿上微生物回收率的影响较大：灭菌次数对回收率也有一定影响；金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌对汽化过氧化氢灭菌剂的敏感程度较高。隔离系统应用于无菌检查时，应对培养基和样品包装进行完整性验证，排除灭菌处理可能带来的假阴性风险。

  中国药典2015年版(ChP 2015)首次收载了无菌检查用隔离系统验证指导原则，使用无菌隔离系统己成为药品无菌检查的趋势。隔离系统作为传统洁净室的替代技术，可有效控制其内部的洁净环境。作为一个密闭的操作系统，隔离系统通过可截留微生物的高效空气过滤系统实现与外界的空气交换，舱体内部采用经验证的方式对物品进行表面灭菌，可用于表面灭菌的气体有过氧化氢、二氧化氯、臭氧、过氧乙酸等，其中过氧化氢以其杀菌效果好、分解快、无残留、对实验用品无损害等优点最为常用。

  隔离系统阻隔了操作人员和舱内洁净环境的直接接触，结合高效的灭菌方式，极大地降低了假阳性风险。通常在灭菌循环过程中灭菌气体不会穿透西林瓶、安瓿、螺旋盖试管等密封完好的容器。然而对于某些包装物，灭菌气体可能会对其产生不利影响，造成微生物生长的抑制，带来假阴性风险，这是隔离系统不同于传统洁净室的因素，须在验证和应用时特别关注。所以，用户应充分评估灭菌剂是否会因为渗透试验耗材和待检样品包装，影响低水平微生物污染的检出。

  隔离系统经过表面灭菌，舱内可达到静态A级洁净度，A级环境每次开展试验均要监测表面微生物和沉降菌，并要定期监测浮游菌和空气悬浮粒子。作为最常用的环境监测平皿，胰酪大豆胨琼脂(tryptose soya agar，TSA)培养基平皿被广泛用于环境微生物监测。用户一般较重视TSA平皿在使用前的培养基适用性检查，却容易忽视其在用于隔离系统时的包装完整性测试，确认其经过灭菌循环后微生物的回收率是否还能达到50％～200％的要求。本研究对3种不同来源的TSA平皿进行了测试，通过微生物试验回收率作为评价指标，评估包装材料、灭菌循环次数、灭菌剂注入量等因素对其微生物试验回收率的影响。

  1.仪器与材料

  1.1 仪器PI一4PM型单向流无菌检查用隔离器系统(上海东富龙爱瑞思科技有限公司)；MIR-254型微生物培养箱(日本Sanyo公司)；KS一18型生物安全柜(美国Thermo—Fisher公司)；全自动培养基灭菌和分装系统(瑞士Integra-Biosciences公司)。

  1.2 试剂和培养基30％过氧化氢溶液(分析纯，国药集团化学试剂公司)；汽化过氧化氢灭菌化学指示剂(德国Johnson&Johnson公司)；TSA培养基(成品培养基A，以下简称“品牌A”，某国产培养基品牌；成品培养基B，以下简称“品牌B”，某进口培养基品牌：自制培养基干粉来源为德国Merck公司)。考虑到不同来源商品化成品TSA平皿的中和剂种类和添加量有所差异，为排除该差异带来的影响，从严设定测试条件，本研究使用的TSA平皿均未添加中和剂。

  1.3 菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMC(B)10104]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]和黑曲霉(Aspegillus niger)[CMCC(F)98003]，均购自中国医学细菌保藏管理中心。

  2.方法与结果

  2.1 汽化过氧化氢穿透性测试将2个化学指示剂分别放入3种用于包装TSA平皿的单层包材中并封口，采用灭菌程序B(过氧化氢注入量约为1 00 g／m3)进行一次灭菌循环，灭菌结束后观察化学指示剂的变色情况，共进行3次测试，以研究汽化过氧化氢穿透包材的能力。

  结果如表1所示，汽化过氧化氢能够穿透纸塑包装，60 g／m3医用透析纸相对于70 g／m3医用透析纸包装更易被穿透，而汽化过氧化氢不能穿透聚酰胺／聚乙烯(PA／PE)复合膜和聚丙烯+聚乙烯．乙烯／乙烯醇共聚物一聚乙烯(PP一(PE．EVOH—PE))共挤膜包装。

  2.2 单层包装各试验菌的回收率

  将2种商品化成品TSA平皿拆掉外部两层包装，保留单层包装，自制平皿仅作单层包装，试验组放入隔离器系统操作舱内，分别用4种不同的模式进行表面灭菌处理：

  (1)灭菌程序A(过氧化氢注入量约为50 g／m3)进行一次灭菌循环；

  (2)灭菌程序A进行连续两次灭菌循环；

  (3)灭菌程序B(过氧化氢注入量约为100 g／m3)进行一次灭菌循环；

  (4)灭菌程序B进行连续两次灭菌循环。每种模式分别进行3次测试。

  灭菌程序A和B均经过灭菌验证，均能使生物指示剂下降超过6个对数值，可用于日常无菌检查。同步设置阳性对照组，不进行表面灭菌处理。

  表面灭菌结束后，将试验组TSA平皿转移至生物安全柜内，和阳性对照组TSA平皿同步进行涂布试验，涂布用的5种试验菌按照ChP 2015四部通则1105的规定，制成含菌量不超过100 CFu的菌悬液，每种试验菌平行涂布2块平皿，涂布完成后置规定条件培养。

  如表2所示，在单层包装试验条件下，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌对汽化过氧化氢灭菌的敏感程度较高，品牌A在灭菌剂注入量达到100 g／m3时，金黄色葡萄球菌的平均回收率小于50％，在灭菌剂注入量达到200 g／m3时，铜绿假单胞菌的平均回收率为44．6％，金黄色葡萄球菌的回收率低至18．6％。枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉则对过氧化氢灭菌气体的敏感程度较低，3种TSA平皿在4种灭菌模式下的平均回收率均达到了90％以上。

  2.3双层包装各试验菌的回收率

  根据单层包装试验结果，补充了以下试验：将2种商品化成品TSA平皿保留两层包装，自制平皿作两层包装，试验组放入隔离器系统操作舱内，分别按“2．2”项下的四种模式进行表面灭菌处理，阳性对照组不进行表面灭菌处理。表面灭菌结束后，按“2．2”项下方法进行涂布试验，试验菌为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

  结果如表3所示，品牌A在保留双层包装后，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在4种灭菌模式下的微生物试验回收率均达到了80％以上，品牌B和自制平皿的微生物试验回收率仍保持在80％以上。

  商品化的环境采样平皿包装常含有透气组件，在隔离系统的表面灭菌处理过程中，灭菌剂可能存在穿透作用。此次研究通过化学指示剂试验发现在隔离系统常用的汽化过氧化氢灭菌方式处理下，PA／PE复合膜和PP一(PE—EVOH—PE)共挤膜包装不易被穿透，而纸塑包装形式可能被汽化过氧化氢穿透，穿透渗入的过氧化氢可能会对采样平皿造成不利影响，而通过微生物回收率试验可以直观地验证其效果。本次研究发现确实存在汽化过氧化氢穿透纸塑包装从而影响培养基性能的情况，而较薄规格的纸塑包装相对于较厚规格的包装受影响更为明显。

  3.讨论

  目前市面上的商品化环境监测培养基多为三层无菌包装，该设计主要针对洁净室不同洁净级别间的传递需要，而隔离系统采用高效的表面灭菌，包装材料对汽化过氧化氢的渗透和吸附作用会影响包装内环境监测平皿的微生物试验回收率。建议用户不必拘泥于是否一定拆至单层包装，而是要考虑包装材质和灭菌过程的适应性。灭菌次数对纸塑包装平皿的微生物试验回收率有一定程度的影响，用户可根据隔离系统所使用的灭菌剂特点，选择添加中和剂的环境菌测试平皿，一定程度上可以消除灭菌气体的抑菌作用。

  汽化过氧化氢作为一种典型的低温蒸汽灭菌方式，其灭菌过程中的影响因素较为复杂，而灭菌剂的注入量是影响过氧化氢灭菌效果的关键因素。本次研究也发现灭菌剂注入量明显影响了敏感菌株的回收率，甚至可能达不到药典规定的回收率要求，用户应根据生产厂商的使用要求、自身工作需要等综合测试评估，开发出合理的灭菌程序，避免因盲目追求过量杀灭造成灭菌剂残留和假阴性风险增加等问题。灭菌循环次数、灭菌剂注入量作为隔离系统灭菌程序的一部分，是经开发验证固定下来的，在此基础上用户可对TSA平皿的包装材料与灭菌程序的兼容性进行验证，若通过可不必重复验证。灭菌程序或包装材料任意一方更改时，应重新验证。建议使用经验证的灭菌程序进行不少于两次连续灭菌，以此严苛条件对包装材料的包装完整性进行测试。本次研究也发现，有些试验菌对过氧化氢表面灭菌表现出较强的耐受能力，而有些试验菌则较为敏感，建议用户在进行环境监测平皿的包装完整性研究时重点关注，另外可以增加历史环境菌作为测试菌株。

  需要说明的是，本文提供的环境监测平皿包装完整性测试思路可供其他案例参考，但本文中所测试的微生物回收率结果不能直接使用，因为不同案例隔离系统灭菌程序的差异，所测试的环境菌平皿培养基来源的差异、包装材料的差异都会影响最终结果，应以各案例实际测试结果为准。

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