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挖掘微生物中的“暗物質” 探索未知抗生素新方法


录入时间:2015-6-26 8:52:11
   
   另辟蹊徑尋找抗生素
  Robert Heinzen第一次試圖讓貝氏柯克斯體菌自己生長卻慘遭失敗。這種會引發被稱為Q熱的類似流感狀疾病的細菌,通常隻在其感染的細胞中分裂。這迫使研究人員不得不在哺乳動物的組織中使其生長出來,並且阻礙了他們研究這種微生物的努力。當上世紀90年代初Heinzen在博士后期間試圖找到一種不同的方式培養這種細菌時,他得到的只是半本潦草的筆記。
  不過,這個問題讓他終日不得安寧。直到2003年,貝氏柯克斯體的基因組被測序出來,同時Heinzen在蒙大拿州哈密爾頓市的美國國立衛生研究院落基山實驗室創建了自己的實驗室。他認為,基因組能提供關於這種細菌新陳代謝和生長的重要線索。即便如此,Heinzen指導的博士后Anders Omsland還是花費了近4年的時間系統測試過上百種不同組合的培養條件,才找到在細胞外培養這種細菌的完美“食譜”。“當他把培養菌拿給我看時,我本以為那是一種污染物。”Heinzen回憶說。然而,隨后幾個月的努力証實了他們的成功。
  貝氏柯克斯體依然屬於少數。據估計,有85%~99%的細菌和古生菌尚無法在實驗室中被生長出來。這極大地限制了科學家對微生物生命的了解,並且阻礙了對通常來自細菌的新抗生素的尋找。隨著現有藥物的耐藥性急劇上升,這種研究正變得更加迫切:上個月,世界衛生組織批准一項阻擊抗生素抗藥性的全球計劃,同時一個由英國政府指派的評審小組呼吁全球制藥行業投入13億英鎊(合20億美元)復興抗生素研究。為尋找新藥,研究人員表示,他們需要一些替代方法,以調查一系列未被培養出來的生物體——微生物世界中的神秘“暗物質”。
  雞尾酒培養法
  按照慣例,生物學家通過在一系列相當標准的營養物質中生長出某一物種的純培養物來研究微生物。然而,麻煩在於細菌並不像在自然界中那樣生活:它們居住在一個非常寬廣的環境范圍內,並且通常伴有其他有機體,而科學家一直在試圖重新創造這些條件。不過,正如Heinzen和Omsland在他們關於貝氏柯克斯體的研究中所展示的,基因序列能打開一扇門。
  Omsland利用測序將細菌在宿主細胞內成功生長時所表達的基因同它們試圖獨自生長時所表達的基因進行比較。他發現,一套涉及蛋白質合成的基因在苦苦掙扎的細菌內較不活躍。這暗示,向培養基中加入氨基酸和縮氨酸或許有助於細菌變得繁盛。不過,即使在Omsland成功地將細菌的蛋白質合成增加13倍時,它仍然無法分裂。
  最終的線索來自証明貝氏柯克斯體能在低氧環境中生存下來的基因。當研究團隊將這種細菌放置在5%或者更少的氧氣中時,他們最終看到它在生長。“這是至關重要的發現。”Heinzen表示,它不是營養物質,而是環境因素。
  自從採用無異種生物混雜或沒有宿主的新培養技術,貝氏柯克斯體研究領域得到極大的擴展。通過選擇性地打開或關閉基因,研究人員了解了這種細菌是如何同宿主細胞發生相互作用,進而將后者感染並且發生分裂的。“毫不夸張地說,在無異種生物混雜的情況下生長貝氏柯克斯體已經徹底改變了這個研究領域。”澳大利亞墨爾本大學微生物學家、貝氏柯克斯體研究者Hayley Newton表示。這種細菌在空氣中具有高度傳染性,並且被認為是一個可能的生物威脅。目前,Heinzen的實驗室正致力於制造致病基因已被滅活的菌株,以期它們在研發疫苗時能派上用場。
  同時,研究人員正在設計針對隻在細胞內生長的其他微生物的培養體系。已在華盛頓州立大學就職的Omsland開發出一種針對導致最常見性傳播疾病的病菌——沙眼衣原體的無細胞培養體系。他說,目前尚未誘導沙眼衣原體在培養基中分裂,但“我生性樂觀”,在貝氏柯克斯體上取得成功為他的希望提供了“燃料”。
  微型化的培養物
  加速尋找培養“食譜”過程的一種方法是利用微流體芯片。這是一種擁有被不同通道連接起來、使其有可能同時運行很多試驗的上千個微小凹槽。在利用此方法培養出一種新的細菌后,來自加州理工學院的Rustem Ismagilov和他的合作者甚至將其命名為isolate microfluidicus 1。
  當2012年一群微生物學家發表了一個“最想要的”分類群清單時,Ismagilov已經在研究微流體。當時,他們呼吁科研界生長並且測序在人體內相對常見、同已測序生物體關聯較遠並且躲避所有培養嘗試的微生物。
  Ismagilov和他的團隊用一種容納3200個納升大小的凹槽並且能放在手掌中的設備回應了這種呼吁。他們從一名健康志願者的腸壁上刮取了樣品,然后將其稀釋,以至於每個凹槽中僅有一個細胞。通過填滿如此多的凹槽,研究人員增加了他們的目標微生物—— 一種顫杆菌克屬人體腸道細菌找到進入至少一些凹槽的道路的機會。該團隊利用約10個芯片測試各種條件,並且尋找這種細菌的生長。
  他們成功地找到了細菌,然后在皮氏培養皿中生長出更多的細菌。這是最想要清單上最早被培養出來的成員之一。進一步的遺傳學研究顯示,isolate microfluidicus 1被錯誤地分類,實際上並不是顫杆菌克屬。其實,它是一個新的相關菌群的一部分。目前,該團隊正在描繪新菌群的特征。
  該團隊發現,生長這種細菌的一個重要成分是從志願者腸道內提取出的少量液體。Ismagilov介紹說,能在上千種試驗中擴展這個珍貴樣品的使用是微流體方法的一個重要優勢。另一個優勢在於每個初始細胞無須同其他種群競爭。
  密歇根大學化學工程師Xiaoxia Nina Lin正利用微流體在人體糞便樣品中“追捕”最想要清單上的成員。細菌通常生活在復雜的群落中,並且經常依賴於其他種群。為此,Lin正嘗試將兩個、三個或四個細胞的無數種組合放在一起並且放置在芯片上,以剖析這些關系,並且找到誰依賴誰。“這是一種很好的工程學方法。”正在幫助Lin獲取臨床樣品的密歇根大學傳染性疾病研究人員Vincent Young說,你能快速減少復雜度。
  不要培養要測序
  盡管取得了這些成功,培養細菌仍是一項復雜且需要碰運氣的事情。因此,很多研究人員正在完全繞開它,相反從基因中獲取信息。測序手段的進步意味著現在科學家能分析未被培養出來的單個微生物細胞的基因組,而不是像此前那樣,測序由很多不同類型微生物構成的群落,然后努力將這些序列重新拼湊回去。
  來自美國能源部聯合基因組研究院的Tanja Woyke首次對單細胞測序產生興趣是在十年前一個關鍵發現產生的不久之后。這個發現是一種來自被細菌感染病毒的?能被用於制作一種細菌細胞基因組的很多個副本。Woyke想利用測序工具填寫生命的微生物樹。
  她和團隊成員採集了來自9個不同生境的樣品,包括來自內華達州一處溫泉的沉積物和太平洋深海熱液噴口的水。他們分離出約200個細胞,對每個基因組進行測序,並且把細胞分成20多個不含有任何被培養出來的代表細菌的新世系。“從被分析的序列和單細胞數量這個角度來說,他們首次真正將單細胞基因組學提高到一個新水平。”德國維爾茨堡大學海洋微生物學家Ute Hentschel說。
  去年,來自瑞士聯邦理工學院的J?觟rn Piel和他的同事報告稱,他們利用單細胞測序和其他技術在海綿中確認了未被培養出來的細菌。這些濾食性生物一直是科學家的興趣所在,因為它們產生一系列具有抗癌、抗菌和其他藥物價值的豐富化學物質。它們還庇護著佔據40%海綿質量的密集微生物群落,並且被推測是這些化學物質的來源。不過,這些群落的成員一直未被培養出來。

  Piel和他的團隊將關注點放在Theonella swinhoei海綿上。其庇護著約1000種細菌,並且產生幾十種具有生物活性的已知化合物。2011年,他們開始對從海綿樣品中分離出來的單個細菌細胞的DNA進行測序,並且找到兩個已知涉及具有生物活性的分子生產的基因簇。他們在一種名為Entotheonella的細菌中發現了這些基因。
  不過,最令Piel驚奇的是,這種生物體對同海綿相關的幾乎所有具有生物活性的化合物負責。當序列數據顯示這種細菌庇護著所有必要基因時,這一點變得清晰起來。在Piel從他的合作者那兒接收到關鍵數據時,“我幾乎從椅子上跌下來”。這是一種未被培養出來的細菌能成為具有生物活性的化學物質的如此“天才”生產者的首個証據。“在單一菌株中創造很多不同化合物的能力並不常見。”Piel說。
  目前,Piel的實驗室正試圖將來自Entotheonella的基因簇改造成一種可以培養的生物體比如大腸杆菌,從而使宿主能大量生產化合物。他還在挖掘來自日本、巴布亞新幾內亞和以色列的海綿細菌基因組,以期尋找其他細菌超級生產者。

 

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