这是由于琼脂分布不均导致的。琼脂的比重较大，易下沉至底部，高压灭菌后虽然从外观上看培养基澄清透明，琼脂已经完全溶解，但实际上琼脂仍然集中溶解在底部，导致上层含有极少量琼脂，下层含有大量琼脂，因此制成的平板会出现部分不凝固或凝固不完全的现象，瓶内的培养基冷却后出现分层，下层因含大量琼脂而呈固态，上层琼脂少呈液态。在灭菌前若加热煮沸使琼脂完全溶解分布均匀，灭菌后就不会出现此现象。若灭菌前未进行加热溶解，则灭菌后使用前需充分摇匀，确保溶解在底层的琼脂均匀分散开，也可避免出现平板不凝固或凝固不均匀的问题。
此外，偏酸的环境不利于琼脂的凝固。因此在制备一些pH偏酸的培养基时（pH＜4.5），需将琼脂与其他成分分开灭菌，冷却至50℃左右再混合均匀制成平板。在培养基的制备时若出现琼脂不凝固，也有可能是因为配制或灭菌过程出现问题，导致培养基的pH过低，琼脂不能凝固。
