GB/T 4789.35-2008 食品中乳酸菌检验步骤

7操作步骤
7.1样品制备
7.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
7.1.2冷冻样品可先使其在2℃—5℃条件下解冻，时间不超过18h，也可在温度不超过45℃的条件下解冻，时间不超过15min。
7.1.3固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min一10000r/min均质1min—2min，制成l:10样品匀液；或置于装有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min—2min制成1：10的样品匀液。
7.1.4液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放人装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1：10的样品匀液。
7.2步骤
7.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。
7.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。
7.2.3根据待检样品活菌数的估计，选择2个一3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL稀释液分别置于2个MRS琼脂平板或MC琼脂平板，使用L形棒进行表面涂布。根据样品中所含乳酸菌的种类选择培养基及培养条件，见表1，每一种培养条件的每个稀释度作两个平皿。乳酸菌在MRS和MC培养基上菌落生长形态特征见表2。从样品稀释到平板涂布整个试验过程要求在20min内完成。
表1乳酸菌计数培养基及培养条件的选择

表2乳酸菌在不同培养基上菌落特征

8报告
根据菌落计数结果出具检测报告。将最终确定的乳酸菌菌落数在30—300之间的平板进行计数再乘以相应的稀释倍数，采用10的指数表示，每克（或毫升）食品中所含有的乳酸菌数以“CFU/g（或CFU/mL)”表示。具体方法按菌落总数的规定报告。
9.1纯培养
挑取3个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，乳杆菌属接种于MRS琼脂平板，置36℃士1℃兼性厌氧培养48h。
9.2鉴定
9.2.1双歧杆菌的鉴定按GB/T4789.34操作。
9.2.2涂片镜检：乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞，革兰氏染色阳性。嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0.5um—2.0um，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。
9.2.3 API50CH生化鉴定试剂盒鉴定：选择纯培养平板上的3个独立菌落，分别使用API50CH生化鉴定试剂盒进行生化反应检测，乳酸菌菌种主要生化反应见表3和表4。
表3常见乳杆菌属内种的生化反应

表3常见乳杆菌属内种的生化反应

 食品中乳酸菌检验培养基

 食品中乳酸菌检验程序图