简述固氮菌分离的方法

一、实验目的

  (1) 掌握用选择性培养基从土壤中分离自生固氮菌的方法。

  (2) 学习用选择性培养基从土壤中分离自生固氮菌的技术。

二、原理

  自生固氮菌能够独立生活固氮，可利用空气中的氮气作为氮源，因此，用无氮培养基来分离固氮菌，既能使固氮菌旺盛生长，又能使混合样品中的其它微生物难以生长，具有选择作用。但在分离培养时一定要严格培养基成分(所用琼脂要用蒸馏水浸泡、洗涤几次)，以防带入少量的含氮化合物而使微嗜氮微生物生长。此外，用选择性培养基分离固氮菌还要注意挑菌落的时间，因为在无氮培养基上生长的固氮菌，如果培养时间过长，会向培养基中分泌含氮化合物，从而造成固氮菌大菌落的四周有少数微嗜氮菌落生长。用本方法分离所得到的菌，还应测定它的固氮酶活性，才能最后肯定其是否为固氮菌。本实验仅介绍好气性自生固氮菌和厌氧固氮菌的分离培养方法。

三、实验材料

  (1) 样品肥沃菜园土。

  (2) 培养基阿须贝(Ashby)无氮培养基(HB8540-1无氮培养基阿须贝氏(Ashby)培养基), Burk's 无氮培养基（配方见下文), Do氏低氮培养基(配方见下文)。

  (3) 器材无菌吸管和无菌平皿，无菌水，接种环，酒精灯等。

四、方法与步骤

  (1) 好气性自生固氮菌的加富培养有时从土壤中直接分离自生固氮菌比较困难，须进行加富培养才容易成功。加富方法：将欲分离的土样均匀地撒在无菌的 Burk's 无氮培养基平板上，于28~30℃下培养4~7d。选土粒周围有混浊、半透明的胶状菌落(有的在后期能产生褐色或黑褐色的色素)。进一步采用划线法或稀释平板分离法即可得到自生固氮菌的纯培养。

  也可用Do氏低氮培养基，30℃下加富培养1~2d，即可用作进一步分离的样品。

  (2) 好气性自生固氮菌的分离培养将熔化的阿须贝(Ashby)无氮培养基倒人无菌平板中，凝固后将平板放入65~70℃的烤箱中烘烤15~20min，以除去平板表面的水分。将土样或加富后的土粒样品用无菌水分别稀释至10^-1、10^-2、10^-3稀释度，并将各稀释度的菌液0.1mL加在平板上，用无菌涂布器涂匀后，放28~30℃下恒温培养7d，经过一周后，长出的菌落即为好气性自生固氮菌。

  (3) 嫌气性自生固氮菌的分离培养方法固氨菌中还有一部分属于厌氧的，它们主要是固氮螺菌(Azospirillum)和固氮梭菌，如巴斯德梭菌(Clostridium pasturiuanum)。分离它的培养基、分离方法与普通的稀释平板法相同(采用混菌法，培养基倒多一点，让菌在培养基里面生长)，要求稀释操作更迅速，做好后迅速置厌氧条件下培养。

  (4) 挑菌培养并保存挑取纯化的菌落转接在适当的培养基斜面上置于28~30℃下培养好后，于冰箱中保存备用。

五、记录实验结果

六、其他

  Burk's无氮培养基配方：

  Do氏低氮培养基：

注：参考文献：杜连祥，路福平，微生物学实验技术【M】北京：中国轻工业出版社，2008：131-132.

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

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